腸内微生物叢と腸の健康との相互作用に関連する基本的な生物学的研究に役立つこの方法.さらに, このプロトコルは、潜在的なプロバイオティクスと栄養補助食品のスクリーニングに使用して腸の健康上の問題を治療するために, 漏れやすい腸症候群や炎症性腸疾患など.このプロトコルは、高スループットイメージングシステムを使用して、様々な細菌および化学物質で処理されたC.elegansの腸透過性の迅速かつ正確な定量分析を可能にする。
この手法に精通していない科学者は、誤ったラベルやその他の間違いを避けるためにサンプルの数を制限することをお勧めします。この手順は、96ウェルプレートへのワームの転送やOperettaマシンの使用、ハーモニーソフトウェアなど、視覚的なデモンストレーションを必要とする多くのステップで構成されています。滅菌LB培地の500ミリリットルを調製することによって開始します。
P.aeruginosaの単一コロニーを培地に接種し、150rpmで振りながら摂氏37度で14〜15時間培養する。翌日、細菌培養物を2本の500ミリリットルチューブに均等に分配し、3、220倍g、摂氏4度で30分間遠心分離する。上清を取り除き、各チューブに25ミリリットルを残し、残りの総容量は50ミリリットルで、細菌ペレットを再懸濁する。
細菌培養物は、使用できる状態になるまで摂氏4度で保存します。C.elegansの腸透過性に及ぼす細菌の影響をテストするには、冷蔵庫から培養物を取り除き、それらを徹底的に渦液にします。各新鮮なNGMプレートに合計800マイクロリットルを加え、プレートを一晩20°Cのインキュベーターで乾燥させます。
薄板を準備するには、NGMの混合物を含む薄暗いのボトルにNGM寒天培地の50ミリリットルを追加し、十分に混ぜます。その後、各90〜15ミリメートルのペトリ皿に媒体の20ミリリットルを注ぎます。各ペトリ皿にNGM培地を含むDMSOを20ミリリットル加えてDMSOプレートを準備し、プレートを少なくとも3時間室温にして固化させます。
800マイクロリットルのボルテックス大腸菌またはP.aeruginosa培養物を新鮮なNGMプレートに広げ、プレートを一晩20°Cのインキュベーターで乾燥させます。S-バッファで年齢同期化されたL4幼虫を洗浄し、異なる細菌や化学物質を含むNGMプレートに約500のワームを移します。その後、48時間摂氏20度でプレートをインキュベートします。
2ミリリットルの熱不活性化大腸菌と4ミリグラムのFITC-dextranを混合して、FITCデキストランを補充したプレートを準備します。20個の新鮮なNGM寒天プレートのそれぞれに混合物の100マイクロリットルを追加し、きれいなラボベンチで1時間乾燥するプレートを許可します。48時間の治療の後、Sバッファーでワームを洗浄し、FITCデキストラン補充プレートとFITCデキストランなしでNGMプレートに移し、プレートを一晩インキュベートします。
翌日、Sバッファでワームを洗い、新鮮なNGM寒天プレートで1時間クロールできるようにします。黒い96ウェルの平底プレートの各ウェルに4%ホルムアルデヒドの50マイクロリットルを加え、各井戸に約50ワームを移します。1~2分後、ホルムアルデヒドをすべて取り出し、100マイクロリットルの取り付け媒体を各ウェルに加えます。
ホルムアルデヒドは有毒な化学物質であり、注意して取り扱う必要があります。蛍光画像をキャプチャするには、イメージングソフトウェア内の「開いた蓋」アイコンを押し、プレートをマシンに挿入します。[設定]をクリックし、プレートタイプを選択して、明視野チャンネルとEGFPチャンネルを追加します。
レイアウトを調整するには、[レイアウト] の選択に移動し、[トラック] を選択します。1 マイクロメートル、平面の数を 10、距離を 1 マイクロメートルに設定します。処理井戸の 1 つとキャプチャ フィールドを 1 つ選択し、[実験の実行] セクションで [テスト] を押します。
画像が十分に満足できる場合は、[設定] セクションに戻り、[リセット] アイコンを押します。次に、ターゲットウェルと適切な数のキャプチャフィールドを選択します。実行実験に移動し、プレート名を入力して[開始]を押します。
蛍光強度を測定するには、画像解析セクションに移動し、画像を入力し、EGFPチャンネルと方法Bを選択してセルを見つけ、原稿の方向に従ってパラメータを調整し、出力として平均を選択します。[適用]アイコンを押して、セットアップを保存します。[評価] セクションに移動してヒート マップとデータ テーブルを取得し、読み出しパラメータを調整してから評価を開始します。
C.elegansは、他の2つの細菌株と比較してP.aeruginosaでインキュベーションした後のFITC-デキストラン蛍光の有意な増加を示し、P.aeruginoaが上皮腸壁に対してより重要な損傷を引き起こし、腸透過性を増加させたことを示した。生きて、熱不活性化P.aeruginosaはC.elegansの腸透過性に非常に異なる効果を引き起こした。熱不活性化の際、蛍光画像と統計データの両方が、P.aeruginosaが線虫に対する毒性を引き起こさなかったことを示す。
DIMによる48時間の共同治療は、P.aeruginosaにさらされたワームの腸内のFITC-dextran蛍光強度を有意に減少させ、DIMが細菌感染によって引き起こされる腸透過性機能不全を治す良い天然物と考えることができることを示している。FITC-デキストランコーティングプレートの調製中は、FITC-dextranの光感度のために光の露出を最小限に抑える必要があることを覚えておくことが重要です。この技術は、細菌をテストすることによって腸内細菌とその活性成分の病原性およびプロバイオティクスの効果を決定するために使用することができます, だけでなく、それらの化学組成.
