Этот метод будет полезен для фундаментальных биологических исследований, связанных с взаимодействием между кишечной микробиотой и здоровьем кишечника. Кроме того, этот протокол может быть использован для скрининга потенциальных пробиотиков и нутрицевтики для лечения кишечных проблем со здоровьем, таких как синдром вытекающей кишки и воспалительных заболеваний кишечника. Этот протокол использует высокой пропускной способности системы визуализации для обеспечения быстрого и точного количественного анализа проницаемости кишечника в C.elegans лечение с различными бактериями и химическими веществами.
Мы рекомендуем ученому, который не знаком с этой техникой, ограничения количества образцов, чтобы избежать неправильной маркировки и других ошибок. Эта процедура состоит из многих шагов, которые требуют визуальной демонстрации, таких как передача червей на 96-хорошо пластин и с помощью машины Operetta, а также программное обеспечение Гармония. Начните с подготовки 500 миллилитров стерильной среды LB.
Привить одну колонию P.aeruginosa в среду, и инкубировать культуру в течение 14 до 15 часов при 37 градусов по Цельсию при тряске при 150 об/мин. На следующий день равномерно распределит бактериальную культуру на две 500-миллилитровые трубки и центрифугировать их при 3, 220 раз г и четыре градуса по Цельсию в течение 30 минут. Удалите супернатант, оставив 25 миллилитров в каждой трубке, для общего оставшегося объема 50 миллилитров, а затем повторно потуперить бактериальные гранулы.
Храните бактериальную культуру при четырех градусах Цельсия до готовности к использованию. Чтобы проверить влияние бактерий на проницаемость кишечника C.elegans, удалить культуры из холодильника, и тщательно вихрь их. Добавьте в общей сложности 800 микролитров к каждой свежей пластине NGM и позвольте пластинам высохнуть в 20-градусной инкубаторе По Цельсию на ночь.
Чтобы подготовить DIM пластины, добавить 50 миллилитров NGM агар среды в бутылку DIM содержащие бульон NGM, и тщательно перемешать. Затем залить 20 миллилитров среды в каждую 90-на-15-миллиметровую чашку Петри. Подготовьте пластины DMSO, добавив 20 миллилитров DMSO, содержащих NGM средний к каждой чашке Петри, и оставить пластины при комнатной температуре, по крайней мере три часа, чтобы укрепить.
Распространение 800 микролитров вихревых E.coli или P.aeruginosa культуры на каждой свежей пластины NGM, и позволяют пластины высохнуть в 20-градусный инкубатор по Цельсию на ночь. Вымойте возраст синхронизированные личинки L4 с помощью S-буфера и перенесите около 500 червей на пластины NGM, содержащие различные бактерии и химические вещества. Затем инкубировать пластины при 20 градусах по Цельсию в течение 48 часов.
Приготовьте пластины, дополненные FITC-dextran, смешивая два миллилитров теплоактивированной E.coli с четырьмя миллиграммами FITC-декстрана. Добавьте 100 микролитров смеси к каждой из 20 свежих агарных пластин NGM и дайте пластинам высохнуть в течение одного часа на чистой лабораторной скамейке. После 48 часов лечения, мыть червей с S-буфер, передать их FITC-декстран-дополненные пластины и NGM пластин без FITC-декстран, и инкубировать пластины на ночь.
На следующий день, мыть червей с S-буфер, и позволить им ползать в свежем NGM агар пластины в течение одного часа. Добавьте 50 микролитров 4%формальдегида в каждую колодец черной, 96-ну, плоской дном пластины, и перенесите около 50 червей в каждую колодец. Через одну-две минуты снимите весь формальдегид и добавьте в каждую хорошо 100 микролитров монтажной среды.
Формальдегид является токсичным химическим веществом и должны быть обработаны с осторожностью. Чтобы запечатлеть флуоресцентные изображения, нажмите значок Open Lid в программном обеспечении для визуализации и вставьте пластину в машину. Нажмите Настройка, выберите тип пластины, и добавить brightfield и EGFP каналов.
Чтобы настроить макет, перейдите к выбору Layout и выберите Track. Установите первое изображение на один микрометр, количество плоскостей до 10, и расстояние до одного микрометра. Выберите одну из лечебных скважин и одно поле захвата и нажмите Test в разделе Run Experiment.
Если изображения являются удовлетворительными, вернитесь в раздел Настройка и нажмите значок сброса. Затем выберите все целевые скважины и подходящее количество полей захвата. Перейти к запуску эксперимента, введите имя пластины, и нажмите Начало.
Чтобы измерить интенсивность флуоресценции, перейдите в раздел Анализ изображений, ввемите изображение и найдите ячейку, выбрав канал EGFP и метод B.Отрегулируйте параметры в соответствии с указаниями рукописи и выберите среднее качество в качестве вывода. Нажмите значок Apply, чтобы сохранить настройку. Получить тепловую карту и таблицу данных, заехав в раздел Оценка и отрегулировать параметр считывания, а затем начать оценку.
C.elegans показал значительное увеличение FITC-декстран флуоресценции после инкубации с P.aeruginosa по сравнению с двумя другими бактериальными штаммами, что свидетельствует о том, что P.aeruginosa вызвало более серьезный ущерб эпителиального кишечного барьера и увеличение кишечной проницаемости. Инактивированная в реальном 2000 году P.aeruginosa вызвала очень различное воздействие на проницаемость кишечника в C.elegans. При тепловой инактивации, как флуоресценции изображения и статистические данные показывают, что P.aeruginosa не вызвало какой-либо токсичности для нематод.
48-часовое совместное лечение DIM значительно снизило интенсивность флуоресценции FITC-декстрана внутри кишечника червей, подвергшихся воздействию P.aeruginosa, что свидетельствует о том, что DIM можно считать хорошим натуральным продуктом для лечения кишечной проницаемости дисфункции, вызванной бактериальными инфекциями. Важно помнить, что во время подготовки пластин с покрытием FITC-dextran необходимо свести к минимуму воздействие света из-за светочувствительность FITC-декстрана. Этот метод может быть использован для определения патогенных и пробиотических эффектов кишечных бактерий и их активных компонентов путем тестирования бактерий, а также их химический состав.
