Bu yöntem bağırsak mikrobiyotası ve bağırsak sağlığı arasındaki etkileşim ile ilgili temel biyolojik çalışmalar için yararlı olacaktır. Buna ek olarak, Bu protokol potansiyel probiyotikler ve nutraceuticals tarama için bağırsak sağlığı sorunları tedavi etmek için kullanılabilir, sızıntılı bağırsak sendromu ve inflamatuar barsak hastalıkları gibi. Bu protokol, çeşitli bakteri ve kimyasallarla tedavi edilen C.elegans'ta bağırsak geçirgenliğinin hızlı ve hassas kantitatif analizini sağlamak için yüksek iş yapma lı görüntüleme sistemi kullansın.
Bu tekniği bilmeyen bir bilim adamının yanlış etiketleme ve diğer hataları önlemek için örnek sayısını sınırlamasını öneririz. Bu yordam, solucanları 96 kuyulu plakalara aktarmak ve Operet makinesinin yanı sıra Harmony yazılımını kullanmak gibi görsel gösteri gerektiren birçok adımdan oluşur. Steril LB orta 500 mililitre hazırlayarak başlayın.
P.aeruginosa'nın tek bir kolonisini ortama aşıla ve kültürü 150 rpm'de sallarken 37 derecede 14 ila 15 saat kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, eşit iki 500 mililitrelik tüpler halinde bakteri kültürü dağıtmak ve 3, 220 kez g ve 30 dakika boyunca dört derece santigrat onları santrifüj. Supernatant çıkarın, her tüp te 25 mililitre bırakarak, 50 mililitre toplam kalan hacmi için, sonra bakteriyel pelet resuspend.
Kullanıma hazır olana kadar bakteri kültürünü dört santigrat derecede saklayın. C.elegans bağırsak geçirgenliği üzerinde bakterilerin etkilerini test etmek için, buzdolabından kültürleri kaldırmak ve iyice girdap. Her taze NGM plakasına toplam 800 mikrolitre ekleyin ve plakaların bir gecede 20 derecelik bir kantinde kurumasını bekleyin.
DIM plakalar hazırlamak için, NGM suyu içeren DIM bir şişe içine NGM agar orta 50 mililitre ekleyin ve iyice karıştırın. Daha sonra, her 90-15 milimetrelik Petri çanak içine orta 20 mililitre dökün. DMSO plakalarını her Petri kabına 20 mililitre NGM ortası ekleyerek hazırlayın ve katılaşmak için plakaları oda sıcaklığında en az üç saat bekletin.
Her taze NGM plaka üzerine girdape E.coli veya P.aeruginosa kültürünün 800 mikrolitre yayılır ve plakaların bir gecede 20 derecelik bir kuluçka makinesinde kurumasını bekleyin. Yaş senkronize L4 larvalarını S-tampon ile yıkayın ve yaklaşık 500 solucanı farklı bakteri ve kimyasallar içeren NGM plakalarına aktarın. Sonra, plakaları 20 derecede 48 saat kuluçkaya yatırın.
FitC-dextran takviyesi plakaları, iki mililitre ısı yayan E.coli'yi dört miligram FITC-dextran ile karıştırarak hazırlayın. 20 taze NGM agar plakasının her birine 100 mikrolitre karışımı ekleyin ve plakaların temiz bir laboratuvar tezgahında bir saat kurumasını bekleyin. 48 saatlik tedaviden sonra solucanları S-tampon ile yıkayın, FITC-dekstran takviyesi plakalara ve FITC-dextran olmadan NGM plakalarına aktarın ve bir gecede tabakları kuluçkaya yatırın.
Ertesi gün, S-tampon ile solucanlar yıkayın ve onları bir saat boyunca taze NGM agar plaka tarama izin verin. Siyah, 96 kuyulu, düz dipli plakanın her kuyuya 50 mikrolitre formaldehit ekleyin ve her kuyuya yaklaşık 50 solucan aktarın. Bir ila iki dakika sonra, tüm formaldehit kaldırmak ve her kuyuya montaj orta 100 mikrolitre ekleyin.
Formaldehit toksik bir kimyasaldır ve dikkatli kullanılmalıdır. Floresan görüntüleri yakalamak için görüntüleme yazılımının içindeki Açık Kapak simgesine basın ve plakayı makineye takın. Kurulum'u tıklatın, plaka türünü seçin ve brightfield ve EGFP kanallarını ekleyin.
Düzeni ayarlamak için Düzen seçimine gidin ve Parça'yı seçin. İlk resmi bir mikrometreye, uçak sayısını 10'a ve mesafeyi bir mikrometreye ayarlayın. Tedavi kuyularından birini ve bir yakalama alanını seçin ve Denemeyi Çalıştır bölümünde Test tuşuna basın.
Görüntüler tatmin ediciyse, Kurulum bölümüne dönün ve Sıfırla simgesine basın. Ardından, tüm hedef kuyuları ve uygun sayıda yakalama alanını seçin. Denemeyi Çalıştır'a gidin, plaka adını girin ve Başlat'a basın.
Floresan yoğunluğunu ölçmek için Görüntü Analizi bölümüne gidin, görüntüyü girin ve EGFP kanalını ve yöntemini seçerek hücreyi bulun B.Parametreleri el yazması yönlere göre ayarlayın ve çıktı olarak ortalamayı seçin. Kurulumu kaydetmek için Uygula simgesine basın. Değerlendirme bölümüne giderek bir ısı haritası ve veri tablosu edinin ve okuma parametresini ayarlayın, ardından değerlendirmeye başlayın.
C.elegans diğer iki bakteriyel suşları ile karşılaştırıldığında P.aeruginosa ile kuluçka sonrası FITC-dekstran floresan önemli bir artış gösterdi, P.aeruginosa epitel bağırsak bariyerinde daha hayati hasara neden olduğunu gösteren ve bağırsak geçirgenliği arttı. Canlı ve ısı yalıtımlı P.aeruginosa C.elegans bağırsak geçirgenliği üzerinde çok farklı etkileri tetikledi. Isı inaktivasyonu üzerine, hem floresan görüntüleri ve istatistiksel veriler P.aeruginosa nematodlar için herhangi bir toksisite tetiklemediğini göstermektedir.
DIM ile 48 saatlik bir co-tedavi önemli ölçüde P.aeruginosa maruz solucanların bağırsakları içinde FITC-dextran floresan yoğunluğunu azalttı, Hangi DIM bakteriyel enfeksiyonların neden olduğu bağırsak geçirgenlik disfonksiyonu tedavi etmek için iyi bir doğal ürün olarak kabul edilebilir göstermektedir. FITC-dextran kaplı plakaların hazırlanması sırasında, FITC-dextran'ın ışık hassasiyeti nedeniyle ışığa maruz kalma durumunu en aza indirmeniz gerektiğini unutmamak gerekir. Bu teknik, bağırsak bakterileri ve aktif bileşenlerinin patojenik ve probiyotik etkilerini belirlemek için bakterileri test ederek, hem de kimyasal bileşimi ni belirlemek için kullanılabilir.
