Cet essai bactérien moléculaire de tuberculose, répond à trois questions principales. Un : Quelle est l’ampleur du fardeau de la maladie du patient ? Deux : Comment le fardeau de la maladie du patient réagit-il au médicament antituberculeux?
Et trois: Quelle est la relation entre le fardeau de la maladie et la réponse au traitement? Cet essai produit un résultat quantitatif du fardeau de tuberculose patient, et mesure comment ce fardeau change avec le traitement dans un court laps de temps. Avec la modification, cette méthodologie peut être appliquée à d’autres pathogènes bactériens.
Nous avons déjà développé la technologie semblable pour le diagnostic des mycobactéries nontuberculous, et des bactéries liées à la maladie pulmonaire obstructive chronique. Lorsque vous exécutez cette technique pour la première fois, regardez la vidéo et pratiquez les étapes. Il est très important de pratiquer avec des échantillons qui ne sont pas nécessaires pour les résultats diagnostiques des patients.
La démonstration visuelle est essentielle parce qu’elle simplifie l’apprentissage et la maîtrise des étapes, en particulier les parties de la méthode qui sont difficiles à expliquer dans le texte. Commencez par préparer les cultures cellulaires. Sur un banc de laboratoire propre ou une cabane de classe 1, récoltez un millilitre aliquots de phase exponentielle bacille Calmette-Guérin ou bcg culture en tubes en plastique de 15 millilitres et fermez-les étroitement.
Lors de la préparation des échantillons d’expectorations du patient, travaillez dans un espace bien ventilé et suivez les lignes directrices du manuel GL One Stop TB. Ouvrez soigneusement la tasse à spécimens et pipette un milliliter aliquots en tubes de centrifugeuse en plastique de 15 millilitres. Ensuite, fermez bien les tubes.
Transférez les tubes de l’échantillon dans une grille immergée dans un bain d’eau préchauffé à 95 degrés Celsius, en vous assurant que les 3/4 de chaque tube sont immergés. Faire bouillir les échantillons pendant 20 minutes. Ensuite, transférer les tubes sur le banc pour les refroidir à température ambiante pendant cinq minutes.
Effectuer l’extraction de l’ARN dans une hotte de fumée si vous utilisez un kit avec du chloroforme phénol ou de l’éthanol capital tumoral. La procédure d’ARN illustrée ici est la procédure d’extraction de chloroforme de phénol. Cependant, d’autres méthodes pour l’extraction de l’ARN peuvent également être utilisées.
Transférer un millilitre aliquots de l’échantillon inactivé par la chaleur à 1,5 millilitre de tubes et piquer 100 microlitres de contrôle d’extraction dans chaque échantillon. Fermez les tubes et mélangez-les en les inversant trois fois. Centrifuger les tubes à 20 000 fois g pendant 10 minutes.
Puis, aspirer le surnatant, laissant 50 microlitres de sédiments. Nous suspendons les sédiments dans 950 microlitres de tampon de lyse par tuyautage et transférons toute la suspension dans les tubes matriciels de lysing fournis avec le kit d’extraction d’ARN. Fermez étroitement les tubes et assurez-vous qu’ils sont étiquetés à la fois sur le couvercle et sur le côté.
Ensuite, homogénéisez les échantillons pendant 40 secondes à 6000 rpm. Centrifugeuse le lysate à 12 000 fois g pendant cinq minutes à température ambiante. Pendant ce temps, préparer des tubes frais d’un millilitre et ajouter 300 microlitres de chloroforme.
Utilisez une pipette d’un millilitre pour aspirer soigneusement le supernatant sans toucher la matrice de lysing et le transférer dans le tube avec le chloroforme. Vortex les tubes pendant cinq secondes et laissez-les se contenter de cinq minutes ou jusqu’à ce que trois phases soient clairement visibles. Centrifuger les tubes à 12 000 fois g pendant cinq minutes.
Ensuite, pipette soigneusement la phase supérieure et le transférer dans un tube de 1,5 millilitre. Ajouter 500 microlitres de glace froide 100% éthanol à l’échantillon, fermer le tube, et l’inverser trois fois pour mélanger. Incuber les tubes à moins 80 degrés Celsius pendant 15 minutes ou à moins 20 degrés Celsius pendant 30 minutes.
Ensuite, chargez les tubes dans une micro centrifugeuse et une centrifugeuse pré-réfrigérées pendant 20 minutes à 13 000 fois g et quatre degrés Celsius. Jetez le supernatant, ajoutez 500 microlitres d’éthanol froid glacé à 70% et centrifugeuse pendant encore 10 minutes à 13 000 fois g. Jetez tout le surnatant.
Et incuber les tubes à 50 degrés Celsius pendant 20 minutes pour sécher la pastille d’acide nucléique, en s’assurant de garder les tubes partiellement ouverts pour permettre l’évaporation de l’éthanol. Ensuite, ajoutez 100 microlitres d’eau libre du noyau à la pastille et incubez à température ambiante pendant cinq minutes. Vortex l’échantillon pendant trois secondes et procéder à l’enlèvement de l’ADN ou le stocker à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi.
L’ADN préparé est un mélange selon les instructions manuscrites et pipette 11 microlitres dans chaque tube contenant de l’extrait d’ARN. Vortex pendant trois secondes et tourner brièvement pour enlever les gouttelettes de la paroi du tube. Ensuite, incubez le tube à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes dans le bloc chaud ou l’incubateur.
Après l’incubation, ajouter un microlitre supplémentaire de l’ADN une enzyme directement au tube, et bien mélanger par vortex. Ensuite, incuber les tubes pendant encore 30 minutes à 37 degrés Celsius. Décongeler et vortex le réaccente d’inactivation de l’ADN.
Ajouter ensuite 10 microlitres à chaque extrait d’ARN. Et incuber les tubes à température ambiante pendant cinq minutes. Vortex les tubes trois fois pendant l’étape d’incubation.
Ensuite, centrifugez le mélange à 13 000 fois g pendant deux minutes et transférez soigneusement le supernatant dans le tube libre de l’ARN de 1,5 millilitre, en vous assurant de ne toucher aucune de la matrice d’inactivation. Diluer tous les échantillons inconnus d’ARN un à dix dans l’eau libre de l’ARN, puis, les mélanger en tourbillonnant pendant cinq secondes et brièvement les faire tourner vers le bas. Décongeler les échantillons de VTT et d’EC-ARN et faire respectivement sept et six dilutions décuplées pour une courbe standard.
Préparez les mélanges de maître RT plus et RT moins PCR selon les instructions manuscrites. Vortex le RT plus mélanger et transférer 16 microlitres dans chaque RT plus tube PCR. Ensuite, vortex le rt moins mélanger et ajouter 16 microlitres dans chaque RT moins tube PCR.
Ajouter quatre microlitres d’extrait d’ARN ou d’eau et dupliquer les tubes RT plus. L’eau est le contrôle non-modèle ou NTC. Ajouter quatre microlitres d’extrait d’ARN ou d’eau aux tubes RT moins.
Chargez les tubes de réaction dans la machine PCR en temps réel, programmez la réaction telle que décrite dans le manuscrit et exécutez la réaction. Pour interpréter la réponse au traitement, utilisez la courbe standard pour convertir les valeurs de CQ en charge bactérienne et calculer la réponse comme le changement de charge bactérienne au cours de la période de suivi du traitement. La chute de la charge bactérienne après le traitement signifie une réponse positive alors qu’aucun changement ou augmentation de la charge bactérienne n’implique une réponse négative.
Pour vérifier que tous les bacilles de M.tuberculosis étaient inactivés par la chaleur, la densité optique des cellules a été mesurée et comparée à celle des cellules vivantes. Aucun changement dans la DO au fil du temps n’a été observé pour les échantillons inactivés par la chaleur indiquant qu’il n’y avait pas de croissance. Des échantillons inactivés par la chaleur ont été incubés à 37 degrés Celsius pour déterminer si l’ARN se dégrade à la suite de l’inactivation thermique des cellules.
Aucune différence n’a été trouvée entre l’ARN récolté immédiatement après l’inactivation thermique, et l’ARN a isolé un, deux, trois et quatre jours plus tard dans les deux cultures de BCG et l’expectoration positive de TB. Lorsque l’enzyme A de l’ARN a été exogènement ajoutée aux échantillons, avant et après l’inactivation thermique, la perte d’ARN s’est produite dans tous les échantillons inactivés par la chaleur pendant quatre jours d’incubation. L’effet de l’inactivation thermique sur l’ARN ribosomal a été mesuré dans les cultures et les expectorations de BCG des patients positifs à la tuberculose.
La charge bactérienne mesurée de la culture de contrôle était plus élevée que la charge bactérienne combinée de culture inactivée par la chaleur à 80 degrés Celsius, 85 degrés Celsius et 95 degrés Celsius pour les échantillons de BCG et d’expectorations. L’inactivation thermique des échantillons entraîne une perte minimale d’ARN, laissant un ARN adéquat pour la TB-MBLA en aval et d’autres tests moléculaires en aval. La microscopie électronique de transmission a été employée pour étudier si les cellules lysed par l’inactivation de chaleur.
L’inspection des cellules au grossissement inférieur et supérieur a indiqué les parois intactes de cellules et les corps intracellulaires visibles de lipide. Les cellules semblaient allongées, mais pas lysed. Lorsque vous essayez cette procédure, il est essentiel de se rappeler d’ajouter le contrôle d’extraction, qui contrôle tous les résultats négatifs faux en raison d’une mauvaise extraction de l’ARN.
Cette approche peut être appliquée aux bactéries associées à la maladie pulmonaire obstructive chronique, à l’infection nontuberculous de mycobactéries, et à d’autres agents pathogènes respiratoires. Les résultats quantitatifs de tb-MBLA ont permis la modélisation mathématique et pharmaco-modélisation de la façon dont les patients réagissent à un traitement de la tuberculose. Nous sommes impatients d’appliquer la technique dans les soins de routine où les patients tuberculeux sont pris en charge.
