该协议是重要的，因为它允许对中性粒细胞群进行体外分析，从而克服了我们目前无法进行实验的许多限制。该技术的主要优点是，它提供了容易访问分泌的细胞因子和脂质介质，中性粒细胞在蜂拥期间释放，并允许定量成像分析。当我们将这项技术应用于嗜中性粒细胞时，它可以扩展以分析其他白细胞的迁移，如单细胞和T细胞。
首先，制备每毫升1.6毫克的阳离子多电子光石或CP溶液，将适当数量的CP粉末加入水中，并在搅拌板上混合过夜，或直到所有固体溶解。如果需要，可以通过添加标有 FITC 的多 L-lysine 来使溶液成为荧光。使用标准光刻程序生成主硅晶圆。
此处使用的设计是一个四到四毫升的矩形阵列，直径为 30 微米填充的圆圈，具有 150 微米的中心到中心间距，但可以根据需要修改，以适合不同的应用。将一层 40 微米厚的负光处理层旋转到硅晶圆上。然后在65摄氏度下烘烤晶圆5分钟。
和95摄氏度10分钟。通过镀铬光面罩将晶圆暴露在紫外光照下，每厘米方为 150 至 160 毫焦耳。在65摄氏度下再次烘烤晶圆5分钟，95摄氏度烘烤10分钟。
然后潜入光师开发人员 10 分钟。用异丙醇冲洗。该模式现在应在晶圆上可见。
接下来，彻底混合聚二甲基硅氧烷（PDMS）及其固化剂的10比1的比例。将未处理的混合物倒在培养皿的主晶圆上。真空处理未加热的 PDMS 混合物，直到不存在气泡。
然后在65摄氏度过夜治愈。第二天，使用手术刀切割晶圆的图案部分的外部。然后慢慢拆下固化的 PDMS 板，将其放置在带图案的朝上清洁的切割板上。
用 8 毫米活检冲孔从 PDMS 板中打出单独的邮票，并面朝下将每个邮票放在胶带上以清除碎屑。随着这些邮票朝上，每个邮票的底面与100微升的预先准备的CP解决方案，确保没有气泡形成之间的解决方案和邮票。然后将图章倒置到 CP 溶液的一层上，并在一小时后将其删除。
将每个湿印压面向下涂抹在干净的玻璃滑梯上六到八次，以去除多余的液体。然后真空处理邮票一到两分钟。在干净的玻璃滑梯上粘上八孔、八毫米直径的成像空间，作为邮票放置的指南。
将图章面朝下放在成像空间器每个井中央的玻璃幻灯片上。然后在每个邮票上放置一个 5.6 克的平衡重量，并留出 10 分钟进行冲压。从幻灯片上取下重量和图章，让 CP 层在室温下干燥 24 小时，然后再添加生物颗粒。
如果 CP 带有 FITC 标记，则使用荧光显微镜检查冲压的有效性。将空白 PDMS 板切割到成像分张器的大小，并使用 8 毫米活检冲孔在 PDMS 中创建与消热器孔对齐的孔。然后将 PDMS 板粘附在玻璃幻灯片上。
解冻生物粒子溶液，稀释至每毫升500微克进行注射。在玻璃滑梯上的每个 PDMS 井中加入 100 微升的生物颗粒溶液，然后摇动幻灯片 30 分钟。用水彻底冲洗水，并用荧光显微镜检查幻灯片上的图案。
生物粒子微粒可以在4摄氏度的无尘环境中储存长达三个月。在 IMDM 中，每毫升 7.5 倍至第五毫升细胞用 0.4% 的人血清白蛋白重新产生细胞，以准备细胞。将悬浮液的100微升添加到含有生物粒子微孔的PDMS井中，确保细胞悬浮液在PDMS顶部凸升，且不含任何气泡。
用直径为 12 毫米的盖滑封住井，然后用钳子轻轻按下，使多余的细胞悬浮液逃到井的边缘，然后使用纸巾去除多余的。要对细胞进行成像，在装有37摄氏度、5%二氧化碳和90%相对湿度的显微镜的活细胞成像站的活细胞成像站的细胞上加载微粒阵列。使用时差、荧光和亮场显微镜，在 405 纳米、594 纳米和明亮场下，每 10 秒以 10 倍放大率记录图像。
在37摄氏度和5%的二氧化碳下用生物粒子在井中孵育嗜中性粒细胞3小时，在所需时间点采集样本。使用明亮的场显微镜验证在微阵列上形成成群的。收集单个井的上清液的整个体积，并加载到0.45微米的离心过滤管中，确保分析三重的每个时间点。
在190倍的G和20摄氏度下离心管5分钟，并收集过滤体积。然后将样品储存在零下80摄氏度，直到处理时间。尝试此协议时，请与烟罩中的光处理师和开发人员合作。
在从人类献血者那里吸血之前，请制定 IRB 批准的方案。请记住，从人类血液中衍生的材料是 BSL2。当嗜中性粒细胞被添加到生物粒子微阵列中时，接触生物粒子簇的嗜中性粒细胞被激活并启动蜂群反应。
利用延时荧光显微镜验证了生物粒子微量阵列，以跟踪嗜中性粒细胞向生物粒子簇的迁移。在30至60分钟的暴露后，每个聚类周围形成稳定的嗜中性粒细胞群。相比之下，在没有生物粒子簇的情况下，嗜中性粒细胞不会表现出集体迁移。
染色中性粒细胞核的荧光强度用于确定生物粒子团周围的平均群大小约为1490微米平方。在没有聚类的情况下，给定感兴趣区域的荧光会随着时间的推移而保持不变。嗜中性粒细胞迁移的轨迹表明，当存在微粒组时，嗜中性粒细胞聚集在生物粒子簇上，但在控制系统中未观察到汇合。
测量了蜂拥和非活化中性粒细胞的速度，发现速度分布有统计学上显著差异。成群的嗜中性粒细胞的平均速度为每分钟20.6微米，而控制嗜中性粒细胞的平均速度为每分钟2微米。随着时间的推移，对嗜中性粒细胞在蜂拥而至期间释放的16种蛋白质的浓度进行了分析。
10种蛋白质的浓度增加。两个减少。其余四个在蜂拥而至的第一个小时内有所增加，但之后减少了。
执行此过程时，请确保所有内容清洁，并且您的邮票正确干燥，因为这些对于细菌颗粒的成功图案至关重要。这项技术的发展将使研究人员能够探索嗜中性粒细胞群领域的新问题，包括自由调停器和细胞外囊泡如何参与中性粒细胞间交流。
