Questo protocollo è significativo perché consente un'analisi in vitro dello sciame neutrofilo, che supera molti limiti della nostra attuale incapacità di sperimentare. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce un facile accesso alle citochine secrete e ai mediatori lipidici che i neutrofili rilasciano durante lo sciame e consente l'analisi quantitativa dell'imaging. Mentre applicamo questa tecnica ai neutrofili, potrebbe essere estesa per analizzare la migrazione di altri globuli bianchi come monociti e cellule T.
Inizia preparando una polielettrolite cationica da 1,6 milligrammi per millilitro, o soluzione CP, aggiungendo la giusta quantità di polvere CP all'acqua e mescolandola sulla piastra di agitazione durante la notte o fino a quando tutti i solidi non vengono sciolti. Se lo si desidera, la soluzione può essere resa fluorescente aggiungendo poli-L-lisina etichettata con FITC. Generare il wafer di silicio principale utilizzando procedure di fotolitografia standard.
Il design utilizzato qui è un array rettangolare da quattro a quattro millilitri di cerchi riempiti di 30 micrometri di diametro, con una spaziatura da centro a centro di 150 micrometri, ma può essere modificato come desiderato per diverse applicazioni. Spin-coat uno strato di 40 micrometri di fotoresist negativo su un wafer di silicio. Quindi cuocere il wafer a 65 gradi Celsius per cinque minuti.
E 95 gradi Celsius per 10 minuti. Esporre il wafer alla luce UV attraverso una fotomaschera cromata con 150-160 millijoule per centimetro squadrato. Cuocere di nuovo il wafer a 65 gradi Celsius per cinque minuti e 95 gradi Celsius per 10 minuti.
Quindi immergerlo nello sviluppatore fotoresist per 10 minuti. E sciacquarlo con alcol isopropile. Il motivo dovrebbe ora essere visibile sul wafer.
Quindi, mescolare accuratamente un rapporto 10 a uno di polidimetilsiloxano, o PDMS, prepolimero e il suo agente polimerizzante. E versare il composto non curato sul wafer principale in una piastra di Petri. Trattare sottovuoto la miscela PDMS non curata fino a quando non sono presenti bolle d'aria.
Quindi curarlo durante la notte a 65 gradi Celsius. Il giorno successivo, usa un bisturi per tagliare intorno all'esterno della sezione modellata del wafer. E rimuovere lentamente la lastra PDMS polimerizzata, posizionarla su un tagliere pulito con il lato modellato rivolto verso l'alto.
Punzonare i singoli timbri dalla lastra PDMS con un punzone di biopsia di otto millimetri e posizionare ogni timbro a faccia in giù sul nastro adesivo per rimuovere i detriti. Con questi francobolli rivolti verso l'alto, innescare ogni timbro con 100 microlitri della soluzione CP pre-preparata, assicurando che non si formino bolle d'aria tra la soluzione e il timbro. Quindi invertire i timbri su uno strato di soluzione CP e rimuoverli dopo un'ora.
Tamponare ogni timbro bagnato a faccia in giù su uno scivolo di vetro pulito da sei a otto volte per rimuovere il liquido in eccesso. Quindi aspirare trattare i francobolli per uno o due minuti. Aderire a un distanziale per l'imaging di otto pozzi e otto millimetri di diametro sopra uno scivolo di vetro pulito come guida per il posizionamento del timbro.
Posizionare un timbro a faccia in giù sullo scivolo di vetro al centro di ogni pozzo del distanziale per immagini. Quindi posizionare un peso bilanciato di 5,6 grammi sopra ogni timbro e lasciare 10 minuti per la timbratura. Rimuovere i pesi e i timbri dallo scivolo e lasciare asciugare lo strato CP a temperatura ambiente per 24 ore prima di aggiungere bioparticelle.
Se il CP è contrassegnato con FITC, verificare l'efficacia della stampa con un microscopio fluorescente. Tagliare una lastra PDMS vuota alle dimensioni del distanziale di imaging e utilizzare il punzone di biopsia di otto millimetri per creare pozzi nel PDMS che si allineano con i pozzi del distanziale. Quindi aderire alla lastra PDMS allo scivolo di vetro.
Scongelare una soluzione di bioparticelle e diluirla a 500 microgrammi per millilitro in acqua per iniezione. Aggiungere 100 microlitri di soluzione di bioparticella ad ogni PDMS bene sullo scivolo di vetro e scuotere lo scivolo per 30 minuti. Risciacquare accuratamente i pozzi con acqua e controllare il motivo sullo scivolo con un microscopio fluorescente.
Il microarray di bioparticelle può essere conservato in un ambiente privo di polvere a quattro gradi Celsius per un massimo di tre mesi. Preparare le cellule riutilizzandole a 7,5 per 10 alla quinta colonna per millilitro in IMDM con albume di siero umano allo 0,4%. Aggiungere 100 microlitri della sospensione a un pozzo PDMS contenente il microarray della bioparticella, assicurandosi che la sospensione cellulare sia convessa sopra la parte superiore del PDMS bene e non contenga bolle.
Sigillare il pozzo con un coperchio di 12 millimetri di diametro scivolare e premere delicatamente verso il basso con una pinzetta in modo che la sospensione cellulare in eccesso fuoriesca sul bordo del pozzo, quindi utilizzare un tessuto per rimuovere l'eccesso. Per immaginare le cellule, caricare l'array di microparticelle con le celle sulla stazione di imaging delle cellule vive di un microscopio dotato di un incubatore di gabbie impostato su 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica e umidità relativa del 90%. Usa la microscopia a campo luminoso, fluorescente e a vuoto per registrare immagini con ingrandimento 10 volte ogni 10 secondi a 405 nanometri, 594 nanometri e campo luminoso.
Incubare i neutrofili nei pozzi con bioparticelle a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per tre ore, prelevando campioni nei punti di tempo desiderati. Utilizzare un microscopio a campo luminoso per verificare che gli sciami si siano formati sul microarray. Raccogli l'intero volume di supernatante di un singolo pozzo e caricalo in un tubo filtrante di centrifuga da 0,45 micrometri, assicurandoti di analizzare ogni punto di tempo in triplice copia.
Centrifugare i tubi a 190 volte G e 20 gradi Celsius per cinque minuti e raccogliere il volume filtrato. Quindi conservare i campioni a meno 80 gradi Celsius fino al tempo di elaborazione. Quando si tenta questo protocollo, lavorare con fotoresist e sviluppatore nel cofano dei fumi.
Avere un protocollo approvato dall'IRB prima di prendere il sangue dai donatori umani. Ricorda che i materiali derivati dal sangue umano sono BSL2. Quando i neutrofili vengono aggiunti al microarray della bioparticella, i neutrofili che contattano gli ammassi di bioparticelle si attivano e avviano la risposta brulicante.
Il microarray di bioparticelle è stato convalidato utilizzando la microscopia fluorescente time lapse per tracciare le migrazioni dei neutrofili verso gli ammassi di bioparticelle. Gli sciami neutrofili stabili si formano intorno a ciascun ammasso dopo 30-60 minuti di esposizione. Al contrario, i neutrofili non mostrano una migrazione collettiva in assenza di cluster di bioparticelle.
L'intensità di fluorescenza dei nuclei neutrofili macchiati è stata utilizzata per determinare che la dimensione media dello sciame intorno agli ammassi di bioparticelle era di circa 1490 micrometri al quadrato. In assenza di ammassi, la fluorescenza di una data regione di interesse è rimasta costante nel tempo. Tracce di migrazione neutrofila mostrano che i neutrofili convergevano su un ammasso di bioparticelle quando uno era presente, ma non è stata osservata alcuna convergenza nel sistema di controllo.
È stata misurata la velocità dei neutrofili brulicanti e non attivi ed è stata riscontrata una differenza statisticamente significativa nelle distribuzioni di velocità. La velocità media per i neutrofili brulicanti era di 20,6 micrometri al minuto, mentre la velocità media per i neutrofili di controllo era di due micrometri al minuto. Le concentrazioni di 16 proteine che i neutrofili rilasciano durante lo sciame sono state analizzate nel tempo.
10 proteine aumentate in concentrazione. Due sono diminuiti. E gli altri quattro aumentarono durante la prima ora di sciame, ma diminuirono in seguito.
Durante l'esecuzione di questa procedura, assicurarsi che tutto sia pulito e che i timbri vengano asciugati correttamente, in quanto questi sono essenziali per un modello efficace delle particelle batteriche. Lo sviluppo di questa tecnica consentirà ai ricercatori di esplorare nuove domande nel campo dello sciame neutrofilo, incluso il modo in cui mediatori liberi e vescicole extracellulari sono coinvolti nella comunicazione intercellulare neutrofila.
