이 프로토콜은 호중구 무리의 체외 분석을 허용하기 때문에 중요하며, 이는 현재 실험할 수 없는 많은 한계를 극복합니다. 이 기술의 주요 장점은 호중구가 무리 중에 방출되고 정량적 이미징 분석을 허용하는 분비된 사이토카인 및 지질 중재자에 쉽게 접근할 수 있다는 것입니다. 우리는 호중구에 이 기술을 적용하는 동안, 단핵구 및 T 세포 같이 그밖 백혈구의 이동을 분석하기 위하여 확장될 수 있었습니다.
밀리리터 양이온 폴리일라이트 또는 CP 용액당 1.6밀리그램을 준비하여 적절한 양의 CP 분말을 물에 추가하고 밤새 또는 모든 고형물이 용해될 때까지 교반판에 혼합하여 시작합니다. 원하는 경우 FITC로 표시된 폴리 L-리신을 추가하여 용액을 형광할 수 있습니다. 표준 포토리소그래피 절차를 사용하여 마스터 실리콘 웨이퍼를 생성합니다.
여기서 사용되는 디자인은 30 마이크로미터 직경의 4mm리터 직사각형 배열로, 150 마이크로미터 중심을 중심으로 간격을 두고 있지만, 다른 용도에 대해 원하는 대로 수정할 수 있다. 실리콘 웨이퍼에 네거티브 포토레지스트의 40 마이크로미터 두께층을 스핀 코트. 그런 다음 웨이퍼를 섭씨 65도에서 5분간 굽습니다.
그리고 10 분 동안 섭씨 95도. 150~160밀리미터곱미터의 크롬 포토마스크를 통해 웨이퍼를 UV 광에 노출시다. 웨이퍼를 섭씨 65도에서 5분간, 섭씨 95도에서 10분간 다시 구워줍니다.
그런 다음 포토레지스트 개발자에게 10분 동안 담급됩니다. 그리고 이소 프로필 알코올로 헹지. 이제 웨이퍼에 패턴이 표시됩니다.
다음으로, 폴리디메틸실록산 또는 PDMS, 프리폴리머 및 그 경화제의 10 대 1 비율을 철저히 혼합한다. 그리고 페트리 접시에 마스터 웨이퍼 위에 경화되지 않은 혼합물을 붓습니다. 진공은 기포가 없을 때까지 경화되지 않은 PDMS 혼합물을 처리합니다.
그런 다음 섭씨 65도에서 하룻밤 동안 치료하십시오. 다음 날, 웨이퍼의 패턴 섹션의 외관 주위를 잘라 메스를 사용합니다. 그리고 경화 된 PDMS 슬래브를 천천히 제거하고 패턴 면이 위로 향하는 깨끗한 도마에 놓습니다.
PDMS 슬래브의 개별 스탬프를 8mm 생검 펀치로 펀치하고 각 스탬프를 접착제 테이프에 엎드려 이물질을 제거합니다. 이러한 스탬프가 위향을 향하도록 미리 준비된 CP 솔루션의 100마이크로리터가 있는 각 스탬프를 프라임하여 솔루션과 스탬프 사이에 기포가 형성되지 않도록 합니다. 그런 다음 스탬프를 CP 솔루션 레이어에 반전시키고 1시간 후에 제거합니다.
젖은 각 스탬프를 깨끗한 유리 슬라이드에 6~8번 내려 놓고 여분의 액체를 제거합니다. 그런 다음 스탬프를 1~2분 동안 진공 청소기로 처리합니다. 스탬프 배치를 위한 가이드로서 깨끗한 유리 슬라이드 위에 8밀리미터 직경의 이미징 스페이서를 부착합니다.
이미징 스페이서의 각 웰 의 중앙에 유리 슬라이드에 스탬프를 아래로 놓습니다. 그런 다음 각 스탬프 위에 5.6 그램의 균형 잡힌 무게를 놓고 스탬핑을 위해 10 분을 허용하십시오. 슬라이드에서 무게와 우표를 제거하고 CP 층이 생체 입자를 추가하기 전에 실온에서 24 시간 동안 건조 할 수 있습니다.
CP가 FITC로 태그된 경우 형광 현미경으로 스탬핑의 효과를 확인하십시오. 빈 PDMS 슬래브를 이미징 스페이서 크기로 자르고 8mm 생검 펀치를 사용하여 스페이서의 우물과 일치하는 PDMS의 우물을 만듭니다. 그런 다음 PDMS 슬래브를 유리 슬라이드에 부착합니다.
바이오 입자의 용액을 해동하고 주입을 위해 물에서 밀리리터 당 500 마이크로 그램으로 희석하십시오. 유리 슬라이드에 각 PDMS에 100 마이크로리터의 생입자 용액을 넣고 30분 동안 슬라이드를 흔들수 있습니다. 우물을 물로 철저히 헹구고 형광 현미경으로 슬라이드의 패턴을 확인하십시오.
생체 입자 마이크로어레이는 최대 3개월 동안 섭씨 4도에서 먼지가 없는 환경에 보관할 수 있습니다. IMDM에서 밀리리터당 5번째 세포에 7.5배 10회에서 0.4%의 인간 혈청 알부민으로 세포를 재연하여 세포를 준비한다. 생체 입자 마이크로 어레이를 잘 포함하는 PDMS에 서스펜션 100 마이크로리터를 추가하여 세포 현탁액이 PDMS 상단에 잘 볼록하고 거품이 포함되어 있지 않은지 확인합니다.
12 밀리미터 직경의 커버 슬립으로 우물을 밀봉하고 핀셋으로 부드럽게 눌러 과도한 세포 현탁액이 우물 가장자리로 빠져 나간 다음 조직을 사용하여 과잉을 제거하십시오. 세포를 이미지화하기 위해, 현미경의 살아있는 세포 이미징 스테이션에 세포와 함께 마이크로 입자 배열을 로드하 37섭씨, 5%의 이산화탄소 및 90%의 상대 습도로 설정된 케이지 인큐베이터가 장착되어 있습니다. 시간 경과, 형광 및 밝은 필드 현미경 검사를 사용하여 405 나노미터, 594 나노미터 및 밝은 필드에서 10 초마다 10배배율로 이미지를 기록합니다.
생체 입자와 함께 우물의 호중구를 37도, 이산화탄소 5%를 3시간 동안 배양하여 원하는 시점에서 샘플을 채취합니다. 밝은 필드 현미경을 사용하여 소열이 마이크로 어레이에 형성되는지 확인합니다. 단일 웰의 전체 상체체 를 수집하고 0.45 마이크로미터 원심분리기 필터 튜브에 적재하여 트리플리케이트의 매 시간 지점을 분석하십시오.
원심 분리는 5 분 동안 190 배 G와 섭씨 20도에서 튜브를 원심 분리하고 여과 된 볼륨을 수집합니다. 그런 다음 처리 시간까지 샘플을 영하 80도에서 보관하십시오. 이 프로토콜을 시도할 때는 연기 후드에서 포토레지스트 및 개발자와 함께 작업합니다.
인간 기증자에게서 혈액을 취하기 전에 장소에 IRB 승인 프로토콜이 있습니다. 인간의 혈액에서 파생 된 물질은 BSL2 것을 기억하십시오. 호중구가 생입자 마이크로어레이에 첨가되면 생체 입자 클러스터에 접촉하는 호중구가 활성화되어 서집 반응을 시작합니다.
생체 입자 마이크로어레이는 시간 경과 형광 현미경 검사를 사용하여 생체 입자 클러스터로의 호중구 이동을 추적하여 검증되었습니다. 안정적인 호중구 군단은 30~60분 동안 노출된 후 각 클러스터 주위에 형성됩니다. 대조적으로, 호중구는 생물 입자 클러스터의 부재에 집단 이주를 표시하지 않습니다.
스테인드 호중구 핵의 형광 강도는 생체 입자 클러스터 주위의 평균 떼 크기가 약 1490 마이크로미터 제곱된 것을 결정하기 위해 사용되었다. 클러스터가 없는 경우, 관심의 주어진 영역의 형광은 시간이 지남에 따라 일정하게 유지. 호중구 이동의 트랙은 호중구가 존재할 때 생입자 클러스터에 수렴되었음을 보여 주지만 제어 시스템에서는 수렴이 관찰되지 않았습니다.
무리와 비활성화 호중구의 속도를 측정하고, 속도 분포에서 통계적으로 유의한 차이가 발견되었다. 호중구 를 무리에 대 한 평균 속도 는 분 당 20.6 마이크로 미터, 제어 호중구에 대 한 평균 속도 분 당 2 마이크로 미터 동안. 호중구가 무리 중에 방출되는 16가지 단백질의 농도는 시간이 지남에 따라 분석되었다.
10 단백질 농도 증가. 2개가 감소했습니다. 그리고 나머지 네 는 무리의 첫 번째 시간 동안 증가하지만 그 후 감소.
이 절차를 수행하는 동안 세균 성 입자의 성공적인 패터닝에 필수적이기 때문에 모든 것이 깨끗하고 우표가 제대로 건조되었는지 확인하십시오. 이 기술의 발달은 유중구 성 소동의 필드에 있는 새로운 질문을 탐구하는 연구원을 가능하게 할 것입니다, 어떻게 자유로운 중재자 및 세포외 소포가 호중구 세포 간 통신에 관련되는가를 포함하여.
