Bu protokol, nötrofil sürüsünün in vitro analizine olanak sağladığı için önemlidir, bu da mevcut deney yapamamamızın birçok sınırlamasını aşabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, nötrofillerin sürü sırasında salgılayan sitokinlere ve lipid arabulucularına kolay erişim sağlaması ve kantitatif görüntüleme analizine olanak sağlamasıdır. Biz nötrofiller için bu tekniği uygulanırken, monositler ve T hücreleri gibi diğer beyaz kan hücrelerinin göç analiz etmek için uzatılabilir.
Mililitre katyonik polielektrolit başına 1,6 miligram veya CP çözeltisi hazırlayarak, suya uygun miktarda CP tozu ekleyerek ve bir gecede veya tüm katılar eriyene kadar karıştırma katarak başlayın. İstenirse FITC etiketli poli-L-lizin eklenerek çözelti floresan yapılabilir. Standart fotolitografi prosedürlerini kullanarak ana silikon gofreti oluşturun.
Burada kullanılan tasarım, 30 mikrometre çapında dolu daireler, merkezi boşluk 150 mikrometre merkezi ile dört tarafından dört mililitre dikdörtgen dizi, ancak farklı uygulamalar için istendiği gibi değiştirilebilir. Spin-coat bir silikon gofret üzerine negatif photoresist 40 mikrometre kalınlığında tabaka. Sonra gofret pişirin 65 santigrat derece beş dakika.
Ve 10 dakika boyunca 95 santigrat derece. Santimetre karesi 150 ila 160 milijoule'luk krom bir fotomaske ile gofretini UV ışığına maruz bırakın. Gofret tekrar 65 derece santigrat beş dakika ve 95 derece santigrat derece 10 dakika pişirin.
Sonra 10 dakika photoresist geliştirici batırın. Ve isopropil alkolle durula. Desen artık gofret üzerinde görünür olmalıdır.
Daha sonra, iyice polidimethylsiloxane veya PDMS, prepolimer ve kür ajan 10-bir oranı karıştırın. Ve bir Petri kabında ana gofret üzerine unred karışımı dökün. Vakum, hava kabarcıkları bulununa kadar lenmemiş PDMS karışımını tedavi edin.
O zaman bir gecede 65 derecede tedavi edin. Ertesi gün, gofret desenli bölümünün dış çevresinde kesmek için bir neşter kullanın. Ve yavaş yavaş kürlenmiş PDMS levha kaldırmak, desenli tarafı yukarı bakacak şekilde temiz bir kesme tahtası üzerine yerleştirerek.
SEKIZ milimetrelik biyopsi zımbaile PDMS levhasından tek tek pulları dışarı atın ve enkaz kaldırmak için yapıştırıcı bant üzerinde her damga yüz aşağı yerleştirin. Bu pullar yukarı bakacak şekilde, her pulu önceden hazırlanmış CP çözeltisinin 100 mikrolitresi ile asal olarak, çözelti ile damga arasında hava kabarcıkları oluşmamasını sağlar. Daha sonra pulları CP çözüm katmanına ters çevirin ve bir saat sonra çıkarın.
Dab her ıslak damga temiz bir cam slayt üzerine yüz aşağı altı ila sekiz kez fazla sıvı kaldırmak için. Sonra vakum bir ila iki dakika için pulları tedavi. Sekiz kuyu, sekiz milimetre çapında görüntüleme spacer damga yerleştirme için bir rehber olarak temiz bir cam slayt üstüne yapıştırın.
Görüntüleme boşluk her kuyunun merkezinde cam slayt aşağı bir damga yüz aşağı yerleştirin. Sonra her damga üstüne 5,6 gram dengeli ağırlık yerleştirin ve damgalama için 10 dakika bekleyin. Slayttaki ağırlıkları ve pulları çıkarın ve cp tabakasının biyopartiküleklemeden önce 24 saat oda sıcaklığında kurumasını bekleyin.
CP FITC ile etiketlenmişse, flüoresan mikroskopla damgalamanın etkinliğini kontrol edin. Boş bir PDMS levhasını görüntüleme uzaylayıcısı boyutuna kesin ve sekiz milimetrelik biyopsi yumruğukullanarak PDMS'de boşlukkuyularıyla uyumlu kuyular oluşturun. Ardından PDMS levhasını cam slayta yapıştırın.
Biyopartiküllerin çözeltisini eritin ve enjeksiyon için sudaki mililitre başına 500 mikrograma seyreltin. Cam slaytta her PDMS'ye 100 mikrolitre biyopartikül çözeltisi ekleyin ve kaydırağı 30 dakika boyunca sallayın. Kuyuları suyla iyice durulayın ve slayttaki deseni floresan mikroskopla kontrol edin.
Biyopartikül mikrodizi, tozsuz bir ortamda dört santigrat derecede üç aya kadar saklanabilir. Hücreleri 7,5 kez 10'da mililitre başına 5 hücreye % 0,4 insan serum albumeni ile yeniden sulandırarak hazırlayın. Biyopartikül mikrodizisini içeren bir PDMS kuyusuna süspansiyonun 100 mikrolitresini ekleyin, hücre süspansiyonunun PDMS'nin üst kısmında konveks olduğundan ve herhangi bir kabarcık içermediğinden emin olun.
12 milimetre çapında kapak kayma ile kuyu mühür ve aşırı hücre süspansiyon kuyukenarına kaçar, sonra aşırı kaldırmak için bir doku kullanın, böylece cımbız ile hafifçe bastırın. Hücreleri görüntülemek için, mikropartikül dizisini 37 santigrat derece, %5 karbondioksit ve %90 bağıl nem oranına ayarlanmış bir kafes kuluçka makinesiyle donatılmış bir mikroskobun canlı hücre görüntüleme istasyonundaki hücrelerle yükleyin. 405 nanometre, 594 nanometre ve parlak alanda her 10 saniyede 10X büyütme görüntüleri kaydetmek için zaman atlamalı, floresan ve parlak alan mikroskobu kullanın.
37 santigrat derece biyopartiküller ve% 5 karbondioksit ile kuyularda nötrofiller inkübün üç saat boyunca, istenilen zaman noktalarında örnekleri alarak. Sürülerin mikrodizi üzerinde oluştuğunu doğrulamak için parlak bir alan mikroskobu kullanın. Tek bir kuyunun süpernatant tüm hacmitoplamak ve bir 0,45 mikrometre centrifuge filtre tüpü içine yükleyin, triplicate her zaman noktası analiz etmek için emin olun.
Tüpleri 190 kez G ve 20 santigrat derecede beş dakika santrifüj edin ve filtrelenmiş hacmi toplayın. Daha sonra örnekleri işleme süresine kadar eksi 80 derecede saklayın. Bu protokolü denerken, duman kaputunda photoresist ve geliştirici ile çalışın.
İnsan donörlerden kan almadan önce IRB onaylı bir protokol uygulayın. İnsan kanından elde edilen malzemelerin BSL2 olduğunu unutmayın. Nötrofiller biyopartikül mikrodizilerine eklendiğinde, biyopartikül kümelerine temas eden nötrofiller aktive olur ve sürü tepkisini başlatır.
Biyopartikül mikrodizi, nötrofil göçlerini izlemek için zaman atlamalı floresan mikroskobu kullanılarak doğrulandı. Kararlı nötrofil sürüleri maruz kalma 30 ila 60 dakika sonra her küme etrafında oluşur. Buna karşılık nötrofiller biyopartikül kümelerinin yokluğunda kolektif göç göstermezler.
Lekeli nötrofil çekirdeklerinin floresan yoğunluğu, biyopartikül kümelerinin etrafındaki ortalama sürü büyüklüğünün yaklaşık 1490 mikrometre kare olduğunu belirlemek için kullanıldı. Kümelerin yokluğunda, belirli bir ilgi bölgesinin floresansı zaman içinde sabit kalmıştır. Nötrofil göçünün izleri nötrofillerin bir biyopartikül kümesi üzerinde birleştiğini gösteriyor, ancak kontrol sisteminde yakınsama gözlenmedi.
Sürü halindeki ve aktive olmayan nötrofillerin hızı ölçüldü ve hız dağılımlarında istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulundu. Sürühalindeki nötrofiller için ortalama hız dakikada 20.6 mikrometre iken, kontrol nötrofilleriçin ortalama hız dakikada iki mikrometre idi. Nötrofillerin sürü ler sırasında salgılayan 16 proteinin konsantrasyonları zaman içinde analiz edildi.
Konsantrasyonu 10 protein arttı. İki azalmış. Ve geri kalan dört swarming ilk saat boyunca arttı ama daha sonra azaldı.
Bu işlemi gerçekleştirirken, her şeyin temiz olduğundan ve pullarınızın düzgün kurutulmasını sağlayın, çünkü bunlar bakteri partiküllerinin başarılı bir şekilde desenlemesi için gereklidir. Bu tekniğin geliştirilmesi araştırmacılar nötrofil swarming alanında yeni sorular keşfetmek için sağlayacak, nasıl ücretsiz arabulucuve hücre dışı veziküller nötrofiller arası iletişim dahil dahil.
