Этот протокол имеет важное значение, поскольку он позволяет в пробирке анализ нейтрофила роятся, что преодолевает многие ограничения нашей нынешней неспособности экспериментировать. Основным преимуществом этого метода является то, что он обеспечивает легкий доступ к секретным цитокинов и липидных посредников, что нейтрофилов релиз во время роятся и позволяет количественного анализа изображений. Хотя мы применили этот метод к нейтрофилов, он может быть расширен для анализа миграции других белых кровяных клеток, как моноциты и Т-клетки.
Начните с подготовки 1,6 миллиграмма на миллилитр катионные полиэлектролита, или CP раствор, добавив надлежащее количество порошка CP в воду и смешивая его на пластине перемешать на ночь или до тех пор, пока все твердые тела растворяются. При желании раствор можно сделать флуоресцентным, добавив поли-L-лизин, помеченный FITC. Создайте мастер кремниевых пластин с использованием стандартных процедур фотолитографии.
Конструкция, используемая здесь четыре на четыре миллилитров прямоугольный массив диаметром 30 микрометров заполнены в кругах, с 150 микрометровый центр в центр интервала, но она может быть изменена по желанию для различных приложений. Спин-пальто 40 микрометров толщиной слой отрицательного фоторезистер на кремниевой пластины. Затем выпекать при температуре 65 градусов по Цельсию в течение пяти минут.
И 95 градусов по Цельсию в течение 10 минут. Выставить пластину на ультрафиолетовый свет через хромированную фотомаску с 150 до 160 миллиджоулей на сантиметр в квадрате. Выпекать снова при температуре 65 градусов по Цельсию в течение пяти минут и 95 градусов по Цельсию в течение 10 минут.
Затем погрузите его в разработчика фоторезистер в течение 10 минут. И промыть его изопропиловым спиртом. Шаблон теперь должен быть виден на пластине.
Далее, тщательно смешать 10 к одному соотношению полидиметилсилоксана, или PDMS, преполимер и его лечебное средство. И налейте неохвекаемую смесь на мастер-вафельку в чашке Петри. Вакуумные лечения неохлестой смеси PDMS до тех пор, пока пузырьки воздуха присутствуют.
Затем вылечить его на ночь при 65 градусах по Цельсию. На следующий день используйте скальпель, чтобы разрезать внешний вид узорчатой части пластины. И медленно удалите вылеченную плиту PDMS, поместив ее на чистую разделочатую доску с узорчатой стороной вверх.
Punch из отдельных марок из плиты PDMS с восемью миллиметрами биопсии удар и место каждой марки лицом вниз на клейкой лентой для удаления мусора. С этими марками вверх, премьер каждой марки с 100 микролитров заранее подготовленного решения CP, гарантируя, что не воздушные пузыри образуются между раствором и печатью. Затем переверните марки на слой раствора CP и удалите их через час.
Dab каждый мокрый штамп лицом вниз на чистую стеклянную горку шесть-восемь раз, чтобы удалить избыток жидкости. Затем вакуум обработать марки в течение одной-двух минут. Придерживайтесь восемь хорошо, восемь миллиметров диаметром изображения пространства на вершине чистого стекла слайд в качестве руководства для размещения штампа.
Поместите штамп лицом вниз на стеклянную горку в центре каждой колодец изображения космонавта. Затем поместите 5,6 грамма сбалансированного веса на верхней части каждой марки и позволяют 10 минут для штамповки. Удалите веса и марки со слайда и дайте слою CP высохнуть при комнатной температуре в течение 24 часов перед добавлением биочастиц.
Если CP помечен FITC, проверьте эффективность штамповки с флуоресцентным микроскопом. Вырежьте пустую плиту PDMS до размера промокера изображения и используйте восьмимиллиметровый пунш биопсии для создания скважин в PDMS, которые выравниваются с колодцами спейсера. Затем примими плиту PDMS к стеклянной горке.
Оттепель раствор биочастиц и разбавить его до 500 микрограмм на миллилитр в воде для инъекций. Добавьте 100 микролитров раствора биочастиц к каждому PDMS хорошо на стеклянной горке и качайте горку в течение 30 минут. Тщательно промыть колодцы водой и проверить рисунок на слайде с флуоресцентным микроскопом.
Микроарей биочастицы можно хранить в безпыльной среде при четырех градусах Цельсия в течение трех месяцев. Подготовьте клетки путем повторного перерасхода их в 7,5 раза от 10 до пятой клетки на миллилитр в IMDM с 0,4%человеческой сыворотки альбумена. Добавьте 100 микролитров подвески в PDMS, хорошо содержащий микроаррей биочастицы, убедившись, что подвеска клетки выпуклые поверх PDMS хорошо и не содержит пузырьков.
Печать хорошо с 12 миллиметров в диаметре крышки скольжения и нажмите вниз осторожно с пинцетом, чтобы избыток подвески клетки убегает к краю хорошо, а затем использовать ткань, чтобы удалить избыток. Для изображения клеток загрузите массив микрочастиц клетками на станции визуализации живых клеток микроскопа, оснащенного инкубатором клетки, установленный на 37 градусов по Цельсию, 5%углекислым газом и 90% относительной влажностью. Используйте промежуток времени, флуоресцентную и яркую микроскопию поля для записи изображений при увеличении 10X каждые 10 секунд на 405 нанометров, 594 нанометров и ярком поле.
Инкубировать нейтрофилов в скважинах с биочастицами при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа в течение трех часов, принимая образцы в нужные моменты времени. Используйте яркий полевой микроскоп, чтобы убедиться, что стаи образуются на микроаррее. Соберите весь объем супернатанта одной колодец и загрузите его в 0,45 микрометровую сантиметровую фильтровальную трубку, убедившись, что каждый раз анализируйте каждую точку времени в тройном.
Центрифуга труб при 190 раз G и 20 градусов по Цельсию в течение пяти минут, и собирать фильтрованный объем. Затем храните образцы при температуре минус 80 градусов по Цельсию до времени обработки. При попытке этого протокола, работа с photoresist и разработчиком в дым капот.
Иметь IRB утвержденный протокол на месте, прежде чем принимать кровь от человеческих доноров. Помните, что материалы, полученные из человеческой крови BSL2. Когда нейтрофилов добавляются в микроаррей биочастиц, нейтрофилов, которые контактируют с кластерами биочастиц, активизируются и инициируют рой реакции.
Биочастицы микроархей был проверен с помощью промежуток времени флуоресцентной микроскопии для отслеживания миграции нейтрофилов к биочастицы кластеров. Стабильные нейтрофиловые стаи образуются вокруг каждого скопления через 30-60 минут воздействия. Нейтрофилов, напротив, не показывает коллективную миграцию при отсутствии биочастиц.
Интенсивность флуоресценции окрашенных нейтрофиловых ядер была использована для определения того, что средний размер роя вокруг кластеров биочастиц составляет около 1490 микрометров в квадрате. В отсутствие кластеров флуоресценция того или иного региона, представляющих интерес, оставалась неизменной с течением времени. Следы миграции нейтрофилов показывают, что нейтрофилов сходились на скоплении биочастиц, когда один присутствовал, но не было замечено сближения в системе управления.
Измерялась скорость роя и неактивированных нейтрофилов, и была обнаружена статистически значимая разница в распределении скорости. Средняя скорость роятся нейтрофилов составила 20,6 микрометра в минуту, в то время как средняя скорость контроля нейтрофилов составила два микрометра в минуту. Концентрации 16 белков, которые нейтрофилов высвобождают во время роя, были проанализированы с течением времени.
10 белков увеличились в концентрации. Два уменьшились. А остальные четыре увеличились в течение первого часа роятся, но уменьшилась после этого.
Выполняя эту процедуру, убедитесь, что все чисто и ваши марки высушиваются должным образом, так как они необходимы для успешного узора бактериальных частиц. Разработка этого метода позволит исследователям изучить новые вопросы в области роятся нейтрофилов, в том числе, как свободные посредники и внеклеточные пузырьки участвуют в нейтрофиловой межклеточной коммуникации.
