פרוטוקול זה הוא משמעותי משום שהוא מאפשר ניתוח במבחנה של נחיל נויטרופילים, אשר מתגבר על מגבלות רבות של חוסר היכולת הנוכחי שלנו להתנסות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת גישה קלה ציטוקיני מופרש ומתווכים השומנים כי נויטרופילים לשחרר במהלך נחיל ומאפשר ניתוח הדמיה כמותית. בעוד יישמו טכניקה זו על נויטרופילים, זה יכול להיות מורחב כדי לנתח את הנדידה של תאי דם לבנים אחרים כמו מונוציטים ותאי T.
התחל על ידי הכנת 1.6 מיליגרם למיליליטר פוליאלקטרוליט cationic, או פתרון CP, על ידי הוספת הכמות הנכונה של אבקת CP למים ערבוב אותו על צלחת מערבבים לילה או עד כל מוצקים מומסים. אם תרצה, הפתרון יכול להתבצע פלואורסצנטי על ידי הוספת פולי-L-ליסטין שכותרתו עם FITC. צור את רקיק הסיליקון הראשי באמצעות הליכי פוטוליטוגרפיה סטנדרטיים.
העיצוב המשמש כאן הוא מערך מלבני של ארבעה על ארבעה מיליליטר של עיגולים מלאים בקוטר 30 מיקרומטר, עם מרכז מיקרומטר 150 למרווח מרכזי, אך ניתן לשנות אותו כרצונו עבור יישומים שונים. ספין-ציפוי שכבה בעובי 40 מיקרומטר של פוטורסיסט שלילי על רקיק סיליקון. ואז לאפות את הוופל ב 65 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.
ו-95 מעלות צלזיוס ל-10 דקות. חשוף את הוופל לאור UV דרך photomask כרום עם 150 עד 160 מיליליטר סנטימטר בריבוע. אופים את הוופל שוב ב 65 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות ו 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
ואז להטביע אותו מפתח photoresist במשך 10 דקות. ולשטוף אותו עם אלכוהול isopropyl. התבנית אמורה להיות גלויה כעת על הוופל.
לאחר מכן, ביסודיות לערבב יחס של 10 לאחד של polydimethylsiloxane, או PDMS, prepolymer וסוכן הריפוי שלה. ויוצקים את התערובת הלא מבושלת על הוופל הראשי בצלחת פטרי. ואקום לטפל בתערובת PDMS uncured עד לא בועות אוויר נמצאים.
ואז לרפא אותו לילה ב 65 מעלות צלזיוס. ביום שלמחרות, השתמש באזמל כדי לחתוך סביב החלק החיצוני של החלק בדוגמת של הוופל. ולהסיר לאט את לוח PDMS נרפא, הצבת אותו על קרש חיתוך נקי עם הצד בדוגמת פונה כלפי מעלה.
אגרוף החוצה בולים בודדים מלוח PDMS עם אגרוף ביופסיה שמונה מילימטר ולמקם כל חותמת עם הפנים כלפי מטה על סרט דבק כדי להסיר פסולת. עם בולים אלה פונים כלפי מעלה, ראש כל חותמת עם 100 microliters של פתרון CP מוכן מראש, להבטיח כי אין בועות אוויר להיווצר בין הפתרון ואת החותמת. ואז להפוך את הבולים על שכבה של פתרון CP ולהסיר אותם לאחר שעה אחת.
לטבול כל חותמת רטובה עם הפנים כלפי מטה על מגלשת זכוכית נקייה שש עד שמונה פעמים כדי להסיר נוזל עודף. ואז ואקום לטפל בולים במשך 1 עד 2 דקות. לדבוק 8 באר, שמונה מילימטר קוטר הדמיה מרחב על גבי שקופית זכוכית נקייה כמדריך למיקום בול.
מניחים חותמת עם הפנים כלפי מטה על מגלשת הזכוכית במרכז כל באר של מרחב ההדמיה. לאחר מכן מניחים משקל מאוזן של 5.6 גרם על גבי כל בול ומאפשרים 10 דקות להטבעה. הסר את המשקולות ואת הבולים מהמגלשה ואפשר לשכבת ה- CP להתייבש בטמפרטורת החדר במשך 24 שעות לפני הוספת חלקיקים ביולוגיים.
אם ה- CP מתויג עם FITC, בדוק את יעילות ההטבעה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. חותכים לוח PDMS ריק לגודל של מרחב ההדמיה ולהשתמש ניקוב ביופסיה שמונה מילימטר כדי ליצור בארות PDMS ליישר עם בארות של רווח. לאחר מכן הצמד את לוח ה- PDMS לשקופית הזכוכית.
להפשיר פתרון של ביו-חלקיקים ולדלל אותו ל 500 מיקרוגרם למיליליטר במים להזרקה. הוסף 100 microliters של פתרון bioparticle לכל PDMS גם על מגלשת הזכוכית ולטלטל את השקופית במשך 30 דקות. שוטפים את בארות ביסודיות עם מים ולבדוק את התבנית על המגלשה עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
ניתן לאחסן את המיקרו-ריי הביו-חלקיקי בסביבה נטולת אבק בארבע מעלות צלזיוס למשך עד שלושה חודשים. הכן את התאים על-ידי שימוש חוזר ב- 7.5 פעמים 10 לתאים החמישיים למיליליטר ב- IMDM עם אלבומן סרום אנושי של 0.4%. הוסף 100 microliters של ההשעיה לבאר PDMS המכילה את microarray bioparticle, לוודא כי ההשעיה התא הוא קמור מעל החלק העליון של היטב PDMS אינו מכיל בועות.
לאטום את הבאר עם 12 מילימטר קוטר לכסות להחליק ולחץ למטה בעדינות עם פינצטה כך ההשעיה תא עודף בורח לקצה הבאר, ולאחר מכן להשתמש ברקמה כדי להסיר את עודף. כדי לדמיין את התאים, טען את מערך המיקרו-חלקיקים בתאים בתחנת ההדמיה של התא החי של מיקרוסקופ המצויד באינקובטור כלובים המוגדר ל-37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו-חמצני ולחות יחסית של 90%. השתמש במיקרוסקופיה של זמן, פלואורסצנטיות ושדה בהיר כדי להקליט תמונות בהגדלה של פי 10 כל 10 שניות ב- 405 ננומטר, 594 ננומטרים ושדה בהיר.
דגירה נויטרופילים בארות עם bioparticles ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך שלוש שעות, לוקח דגימות בנקודות הזמן הרצויות. השתמש במיקרוסקופ שדה בהיר כדי לוודא כי נחילי נוצרים על microarray. לאסוף את כל הנפח של supernatant של באר אחת, טען אותו לתוך צינור מסנן צנטריפוגה 0.45 מיקרומטר, הקפד לנתח כל נקודת זמן ב- triplicate.
צנטריפוגה הצינורות ב 190 פעמים G ו 20 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, ולאסוף את הנפח מסונן. לאחר מכן לאחסן את הדגימות במינוס 80 מעלות צלזיוס עד זמן עיבוד. בעת ניסיון פרוטוקול זה, לעבוד עם פוטורסיסט ומפתח במכסה המנוע אדים.
יש פרוטוקול מאושר IRB במקום לפני לקיחת דם מתורמים אנושיים. זכור כי חומרים שמקורם בדם אנושי הם BSL2. כאשר נויטרופילים מתווספים microarray bioparticle, נויטרופילים כי מגע אשכולות bioparticle להיות מופעל וליזום את התגובה שורצת.
המיקרו-ריי הביו-חלקיקי אומת באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית לשגות זמן כדי לעקוב אחר נדידת נויטרופילים לכיוון אשכולות הביו-חלקיקים. נחילי נויטרופילים יציבים נוצרים סביב כל אשכול לאחר 30 עד 60 דקות של חשיפה. לעומת זאת, נויטרופילים אינם מראים הגירה קולקטיבית בהיעדר אשכולות ביו-חלקיקים.
עוצמת פלואורסצנטיות של גרעיני נויטרופילים מוכתמים שימשה כדי לקבוע כי גודל הנחיל הממוצע סביב אשכולות הביו-חלקיקים היה כ 1490 מיקרומטר בריבוע. בהיעדר אשכולות, הפלואורסצנטיות של אזור עניין נתון נותרה קבועה לאורך זמן. עקבות של נדידת נויטרופילים מראות כי נויטרופילים התכנסו על אשכול ביו-חלקיקים כאשר אחד היה נוכח, אבל לא נצפתה התכנסות במערכת הבקרה.
מהירותם של נויטרופילים נוהרים ולא אקטיביים נמדדה, ומצא הבדל מובהק סטטיסטית בחלוקות המהירות. המהירות הממוצעת של נויטרופילים שורצים הייתה 20.6 מיקרומטר לדקה, בעוד שהמהירות הממוצעת לשליטה בניטרופילים הייתה שני מיקרומטרים לדקה. הריכוזים של 16 חלבונים שנויטרופילים משחררים במהלך הנחילות נותחו לאורך זמן.
10 חלבונים גדלו בריכוז. שניים ירדו. וארבעת הנותרים גדלו בשעה הראשונה של נהרות אך ירדו לאחר מכן.
בעת ביצוע הליך זה, ודא כי הכל נקי ואת הבולים שלך מיובשים כראוי, כמו אלה חיוניים עבור דפוס מוצלח של חלקיקי חיידקים. הפיתוח של טכניקה זו יאפשר לחוקרים לחקור שאלות חדשות בתחום נויטרופילים שורצים, כולל כיצד מתווכים חופשיים ו vesicles חוץ תאיים מעורבים בתקשורת בין תאית נויטרופילים.
