Este protocolo é significativo porque permite uma análise in vitro do enxame de neutrófilos, o que supera muitas limitações da nossa atual incapacidade de experimentar. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece fácil acesso às citocinas secretas e mediadores lipíduos que os neutrófilos liberam durante o enxame e permite a análise quantitativa de imagens. Enquanto aplicamos essa técnica a neutrófilos, ela poderia ser estendida para analisar a migração de outros glóbulos brancos, como monócitos e células T.
Comece preparando uma solução de polieletrolito cônico de 1,6 mililínico por mililitro, ou solução CP, adicionando a quantidade adequada de pó de CP à água e misturando-a na placa de agitação durante a noite ou até que todos os sólidos sejam dissolvidos. Se desejar, a solução pode ser feita fluorescente adicionando poli-L-lysine rotulada com FITC. Gere o wafer de silício mestre usando procedimentos de fotolitografia padrão.
O design usado aqui é uma matriz retangular de quatro por quatro mililitros de 30 círculos preenchidos de diâmetro de 30 micrômetros, com um centro de 150 micrômetros para o espaçamento central, mas pode ser modificado conforme desejado para diferentes aplicações. Gire uma camada de 40 micrômetros de fofuriste negativa em uma bolacha de silício. Em seguida, asse o wafer a 65 graus Celsius por cinco minutos.
E 95 graus Celsius por 10 minutos. Exponha o wafer à luz UV através de uma máscara cromada com 150 a 160 milímetros por centímetro quadrado. Asse o wafer novamente a 65 graus Celsius por cinco minutos e 95 graus Celsius por 10 minutos.
Em seguida, submergir-lo em desenvolvedor fotoresist por 10 minutos. E enxágüe com álcool isopropílico. O padrão agora deve ser visível no wafer.
Em seguida, misture completamente uma razão de 10 a uma de polidimtilsiloxano, ou PDMS, prepolímero e seu agente de cura. E despeje a mistura sem pressa sobre o wafer mestre em uma placa de Petri. O vácuo trata a mistura PDMS nãocurada até que não haja bolhas de ar.
Então cure-o durante a noite a 65 graus Celsius. No dia seguinte, use um bisturi para cortar ao redor do exterior da seção padronizada do wafer. E remova lentamente a laje PDMS curada, colocando-a em uma placa de corte limpa com o lado padronizado voltado para cima.
Soque os selos individuais da laje PDMS com um soco de biópsia de oito milímetros e coloque cada carimbo de cara para baixo na fita adesiva para remover os detritos. Com esses selos voltados para cima, prime cada selo com 100 microliters da solução CP pré-preparada, garantindo que nenhuma bolha de ar se forme entre a solução e o selo. Em seguida, inverta os selos em uma camada de solução CP e remova-os após uma hora.
Dab cada carimbo molhado de cara para baixo em um deslizamento de vidro limpo seis a oito vezes para remover o excesso de líquido. Em seguida, a vácuo trate os selos por um a dois minutos. Adere a um espaçador de imagem de oito poços e oito milímetros de diâmetro em cima de uma lâmina de vidro limpa como guia para a colocação do selo.
Coloque um carimbo de cara para baixo no deslizamento de vidro no centro de cada poço do espaçador de imagem. Em seguida, coloque um peso equilibrado de 5,6 gramas em cima de cada selo e deixe 10 minutos para carimbar. Remova os pesos e os selos do slide e permita que a camada CP seque à temperatura ambiente por 24 horas antes de adicionar biopartículas.
Se o CP estiver marcado com FITC, verifique a eficácia da estampagem com um microscópio fluorescente. Corte uma laje PDMS em branco do tamanho do espaçador de imagem e use o soco de biópsia de oito milímetros para criar poços no PDMS que se alinham com os poços do espaçador. Em seguida, adere a laje PDMS ao escorregador de vidro.
Descongele uma solução de biopartículas e dilua-a a 500 microgramas por mililitro em água para injeção. Adicione 100 microliters de solução de biopartícula a cada PDMS bem no escorregador de vidro e balance o slide por 30 minutos. Enxágüe bem os poços com água e verifique o padrão na lâmina com um microscópio fluorescente.
A microarraia de biopartículas pode ser armazenada em um ambiente livre de poeira a quatro graus Celsius por até três meses. Prepare as células reutilizando-as em 7,5 vezes 10 para a quinta célula por mililitro no IMDM com albumen de soro humano de 0,4%. Adicione 100 microliters da suspensão a um poço PDMS contendo a microarraia de biopartícula, certificando-se de que a suspensão da célula é convexa sobre a parte superior do poço PDMS e não contém bolhas.
Sele o poço com um deslizamento de cobertura de 12 milímetros de diâmetro e pressione suavemente com pinças para que a suspensão do excesso de células escape até a borda do poço, em seguida, use um tecido para remover o excesso. Para imaginar as células, carregue a matriz de micropartículas com células na estação de imagem celular viva de um microscópio equipado com uma incubadora de gaiola situada a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono e 90% de umidade relativa. Use um lapso de tempo, microscopia de campo fluorescente e brilhante para gravar imagens a 10X de ampliação a cada 10 segundos a 405 nanômetros, 594 nanômetros e campo brilhante.
Incubar os neutrófilos nos poços com biopartículas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por três horas, coletando amostras nos pontos de tempo desejados. Use um microscópio de campo brilhante para verificar se os enxames são formados na microarray. Colete todo o volume de supernascer de um único poço e carregue-o em um tubo de filtro de centrífugas de 0,45 micrômetros, certificando-se de analisar cada ponto de tempo em triplicado.
Centrifugar os tubos a 190 vezes G e 20 graus Celsius por cinco minutos, e coletar o volume filtrado. Em seguida, armazene as amostras a menos 80 graus Celsius até o tempo de processamento. Ao tentar este protocolo, trabalhe com fotoresist e desenvolvedor no capô da fumaça.
Tenha um protocolo aprovado pelo IRB antes de tirar sangue de doadores humanos. Lembre-se que os materiais derivados do sangue humano são BSL2. Quando os neutrófilos são adicionados à microarraia de biopartículas, os neutrófilos que entram em contato com os aglomerados de biopartículas tornam-se ativados e iniciam a resposta de enxame.
A microarraia de biopartícula foi validada usando microscopia fluorescente de lapso de tempo para rastrear migrações de neutrófilos em direção aos aglomerados de biopartículas. Enxames de neutrófilos estáveis são formados em torno de cada aglomerado após 30 a 60 minutos de exposição. Em contraste, os neutrófilos não mostram migração coletiva na ausência de aglomerados de biopartículas.
A intensidade da fluorescência de núcleos neutrófilos manchados foi usada para determinar que o tamanho médio do enxame ao redor dos aglomerados de biopartículas foi de aproximadamente 1490 micrômetros ao quadrado. Na ausência de aglomerados, a fluorescência de uma determinada região de interesse permaneceu constante ao longo do tempo. Faixas de migração de neutrófilos mostram que os neutrófilos convergiram em um aglomerado de biopartículas quando um estava presente, mas nenhuma convergência foi observada no sistema de controle.
A velocidade dos nêutrons não ativados e não ativados foi medida, e uma diferença estatisticamente significativa nas distribuições de velocidade foi encontrada. A velocidade média para os neutrófilos enxame era de 20,6 micrômetros por minuto, enquanto a velocidade média para os neutrófilos de controle era de dois micrômetros por minuto. As concentrações de 16 proteínas que os neutrófilos liberam durante o enxame foram analisadas ao longo do tempo.
10 proteínas aumentaram na concentração. Dois diminuíram. E os quatro restantes aumentaram durante a primeira hora de enxame, mas diminuíram depois disso.
Ao realizar este procedimento, certifique-se de que tudo está limpo e seus selos são secos corretamente, pois estes são essenciais para a padronização bem sucedida das partículas bacterianas. O desenvolvimento dessa técnica permitirá aos pesquisadores explorar novas questões no campo do enxame de neutrófilos, incluindo como mediadores livres e vesículas extracelulares estão envolvidos na comunicação intercelular de neutrófilos.
