人类羊膜不同解剖区域的皮下细胞体外培养

该协议可以帮助回答有关从羊膜分离的人类羊膜上皮细胞的异质性和功能特性的关键问题。虽然以前的协议将细胞从共羊膜中分离出来，而不在区域之间辨别，但我们的协议允许从三个不同的解剖区域分离细胞种群的培养。要按区域分离羊膜，在无菌条件下的生物安全柜中，识别包裹脐带的脐带、覆盖脱膜的胎盘膜和反射区域，这被认为是未附着在胎盘上的羊膜的其余部分。

要解剖脐带区域，请使用解剖钳子来容纳覆盖胎盘和脐带交界处的脐带膜部分，并使用手术刀解剖脐带周围的区域，同时拉伸以将区域与胆汁分离。然后，将分离的组织沉积在有标签的烧杯中，并加注100毫升的盐水溶液。要解剖胎盘的 amnion 区域，请使用无菌棉纱布去除覆盖胎盘的胆小板/安尼翁表面的血块。

并使用解剖钳来抓住胎盘和反射区域之间边界上的膜。使用手术刀沿着胎盘的周长切割，将胎盘与胎盘分离，小心不要从胎盘上切割任何血管。将分离的组织放在另一个标有 300 毫升盐水溶液的烧杯中。

将未附着在胎盘上的其他羊膜与胆囊分离。然后，将反射区域放在另一个标有 300 毫升盐水溶液的烧杯中。要清洗膜，请使用钳子将其放在无菌表面上，以便能够丢弃每个组织容器中的盐水溶液。

将膜放回容器中，向脐带添加 100 毫升新鲜盐水溶液，向地盘和反射区域添加 300 毫升新鲜盐水溶液。使用解剖钳来搅拌膜，以去除任何血液残留物，并将膜放在无菌表面上，以便能够丢弃盐水溶液。然后，洗膜至少两次，正如刚刚证明的，直到组织是半透明的。

对于不同羊膜区域的酶消化，将反射区和地盘区域切成两个或三个片段。将碎片和脐带放入单独的50毫升离心管中。将20毫升0.5%的三叶辛-EDTA添加到每管反射和胎盘区域组织片段中，将5毫升0.5%的三叶辛-EDTA添加到含有脐带组织的管子中。

轻轻摇动管子 30 秒。然后将膜放在无菌表面上，丢弃 trypsin-EDTA 溶液，代之以 30 毫升新鲜 0.5% trypsin-EDTA 的反射和胎盘区域组织片段和 15 毫升新鲜 0.5% trypsin-EDTA 的脐带区域组织。然后将管子放在培养箱内的旋转器中，在37摄氏度下以每分钟20次旋转的速度旋转40分钟。

在孵育结束时，将整个细胞溶液体积转移到新的锥形管中。并将37摄氏度的人类 AE 细胞的体积增加两倍，以在冰上的每个管子中。消化原管中任何剩余的组织片段，如刚刚证明的新鲜0.5%的三辛-EDTA。

在第二次消化结束时，使用一对解剖钳子固定 amnion 部分的一端和第二对解剖钳，沿剩余组织挤压，以去除在以前的潜伏期未完全剥离的任何上皮细胞。然后，取出膜，将第二个消化液转移到第二组离心管中。并且用2倍于冰上新鲜37摄氏度人类E细胞培养的体积来灭活消化酶。

对于人类 AE 细胞分离，通过离心沉淀细胞。并重新在每个管中用10毫升的新鲜37摄氏度人类 AE 细胞介质重新暂停颗粒。将每对消化拉入一根管子中，并通过 100 微米滤株过滤悬浮液，以清除任何细胞外基质碎屑。

数数后，将三个区域中每个区域的人类AE细胞在37摄氏度的人类AE细胞培养基中以每厘米的3倍10至第四细胞的三倍10至第四细胞的单独100毫米板，辅以每毫升10毫微克的人类表皮生长因子。然后，在加湿的培养箱中，在37摄氏度的高温条件下孵育培养，直到下游对兴趣进行分析。经过48小时的培养，具有上皮表型的人类 AE 细胞粘附在板的表面，而上经应物包含细胞碎片和漂浮细胞，一旦介质改变，这些细胞可以去除。

建议在识别细菌污染、由于膜洗涤不足而导致的红细胞过多、缺乏或非粘结细胞或具有成纤维细胞形态的细胞时，丢弃培养物并处理另一膜。人类 AE 细胞形态取决于细胞的起源，因为反射区的细胞表现出一种立体形态，并在鹅卵石单层中生长，胎盘和脐带区域的细胞是扁平和鳞状的。对E-cadherin的免疫荧光表明，初级培养物和亚培养物保持其上皮表型，这表明没有其他细胞类型的污染。

此外，这些细胞是可行的，它们表达的Ki-67增殖标记就证明了这一点。虽然来自 amnion 的亚细胞在形态和功能上不同，但多能因子核心的表达和存在在从胎盘和反射区域派生的人类 AE 细胞中不会改变。由于人类羊膜上皮细胞是多能干细胞的可能来源，我们可以通过一系列特定定义协议来挑战它们，以阐明每个区域的这些细胞是否具有不同的潜力。

在开始协议之前，检查患者的病史，以确保组织没有感染的微生物特征。