Channelrhodopsin destekli devre haritalama uzun menzilli nöral projeksiyonların fonksiyonel haritalama için hassas bir tekniktir. Burada, işitsel beyin sapındaki devreleri araştırmak için bu yaklaşımın nasıl kullanılacağını gösteriyoruz. Beyin dilimlerinde, birden fazla kaynaktan aksonlar genellikle birbirine karıştırılır, bu da elektriksel stimülasyon kullanarak bireysel girdileri izole etmeyi zorlaştırır.
CRACM kullanılarak, bu sınırlama aşılabilir. Lambda'yı bulmak ve stereotaksik koordinat sistemini sürekli olarak tanımlamak, prosedürün süresini kısa tutmak gibi zordur. Tüm adımları dikkatle eşlenen olması başarı oranını artıracaktır.
Dezenfekte etmek ve ameliyat alanını kapsayacak şekilde steril havlu perdeleri yerleştirmek için ameliyat alanını %70 etanol ile püskürterek başlayın. Kurtarma kafesinden boğulma riskini sınırlamak için kafes yataklarını çıkarın. Sonra, kafes altında bir ısıtma yastığı koymak ve bir gıda ve su kaynağı sağlar.
Daha sonra, bir stereotaksik çerçeve için hayvan transfer ve anestezi devam edin. Bir rektal sıcaklık probu takın ve homeostatik sıcaklık kontrol cihazını açın. Daha sonra, göz kurumasını önlemek için oftalmik merhem uygulayın.
Preemptive analjezik uygulayın. Son olarak, elektrikli makas ile kafa derisi tıraş. Povison iyot ve% 70 etanol üç alternatif bezleri ile kafa derisi dezenfekte.
Kulaklar arasında başlayan ve gözlere devam rostral, lambda ve bregma dikişleri açığa, orta hat boyunca kafa derisi bir kesi yaparak cerrahi başlar. Cildi yana doğru itin ve gerekirse açıktaki kemikten periostteumu çıkarın. Daha sonra lambda sütüne cerrahi bir belirteç le işaretleyin, nano-enjektörün ucunu sadece lambda'ya dokunup mikromanipülatör koordinatlarını sıfırlayabilsin diye yerleştirin.
Lambda ve bregma dikişleri arasındaki yükseklik farkını ölçmek için nano-enjektör ucu ve mikromanipülatör kullanın. Lambda ve bregma'yı artı veya eksi 100 mikrometre yükseklik farkının içine getirmek için palet çubuğu yüksekliğini ayarlayın. Nano-enjektör ucu ve mikromanipülatör koordinat sistemini kullanarak enjeksiyon bölgesini haritalayın ve bölgeyi bir cerrahi belirteçle işaretleyin.
Daha sonra, enjeksiyon yeri üzerinde kraniyotomi yapmak için 0,5 milimetrelik matkap çapaklı bir mikromotor matkap kullanın. Hedef çekirdekteki nöronların geniş transfeksiyonunu sağlamak için, dokudaki çeşitli derinliklerde enjeksiyonlar yapmak için nano-enjektör kullanın ve inferior kolikulus gibi daha büyük beyin bölgelerinde, farklı X ve Y koordinatlarında iki veya daha fazla penetrasyon sırasında enjeksiyonlar yapın. Inferior kolikulus enjekte etmek için, 2, 250 mikrometre ve 1, 750 mikrometre derinliği arasında Z ekseni boyunca 250 mikrometre aralıklarla virüs 20 nanolitre mevduat.
Dorsal koklear çekirdeğin enjeksiyonları için, sırasıyla 4, 750 mikrometre ve 4, 550 mikrometre derinlikte 20 nanolitre virüs yatırın. Her Z koordinatına enjekte ettikten sonra, virüsün enjeksiyon bölgesinden uzaklaşması için zaman tanımak için enjektörü bir sonraki Z koordinatına taşımadan önce 2-3 dakika bekleyin ve nano-enjektör yeniden konumlandırıldığında virüsün enjeksiyon yoluna çekilme olasılığını azaltın. Sonra, son enjeksiyondan sonra, nano-enjektörü beyinden çekmeden önce 3-5 dakika bekleyin.
Nano-enjektör penetrasyonlar arasında ve hayvanlar arasında beyinden çıkarıldığında, ucun tıkanıp tıkanmadığını kontrol etmek için uçtan küçük bir miktarda virüs çıkar. Enjeksiyonlardan sonra, kafa derisinin kesilmiş kenarlarını ısladıktan sonra cildi yavaşça orta hatta doğru hareket ettirmek için steril PBS kullanın. 6-0 naylon dikişler kullanarak basit kesilmiş dikişler ile yara kapatın.
Daha sonra, yaraya %2 lidokain jölesi 0,5 ila bir mililitre uygulayın. Kulak çubuklarını ve sıcaklık sondasını çıkarın, izofluran'ı çevirin ve hayvanı palet çubuğundan çıkarın ve kurtarma kafesine aktarın. Son olarak, kurtarmayı yakından izleyin.
Bir kez hayvan tamamen uyanık, hareket, ve ağrı veya sıkıntı hiçbir belirti gösteren, onun kafes içine geri aktarın ve vivarium kafes dönmek. Kayıtları yapmak için standart yama kelepçesi yöntemlerini kullanın. Sabit bir sahne dik mikroskop altında bir kayıt odasına dilim yerleştirerek başlayın ve sürekli dakikada iki mililitre yapay beyin omurilik sıvısı ile bol.
Sonra, uygun bir yama kelepçe amplifikatör kullanarak görsel kontrol altında yama nöronlar. Son olarak, toptan kayıtlar sırasında, ticari led'ler aracılığıyla 580 nanometre ışık kısa darbeler ile 470 nanometre ışık veya ChrimsonR kısa darbeler sunarak Chronos etkinleştirin. Sonuçlar, ChrimsonR enjeksiyonu hücre ve liflerde görülen tdTomato floresan ile DCN güçlü bir ifade yol gösterdi.
Kontralateral ICC'de, tdTomato ile güçlü bir şekilde etiketlenmiş lifler üç hafta sonra açıkça görülebiliyordu ve işitsel beyin kök çekirdeklerine enjekte edildiğinde ChrimsonR-tdTomato yapısının uzun menzilli insan ticareti yeteneğini gösteriyordu. ChrimsonR optik aktivasyonu IC VIP nöronlarda epsPs ortaya, ChrimsonR uzun menzilli CRACM deneyleri için yararlı bir araç olduğunu gösteren deneysel parametreler mavi ışık yerine kırmızı ışık kullanımını talep. Ancak, ChrimsonR kolayca mavi ışık ile aktive olduğunu bulundu, Chronos olarak mavi ışık aktivasyonu için aynı eşik gösteren.
Bu protokol için stereotaksik koordinatların doğru olduğundan emin olmak ve virüsün yalnızca hedeflenenizdeki beyin bölgesinde ifade edildiğini doğrulamak en önemlidir. Chronos ChrimsonR viroyapısını farklı bir virüsle, örneğin hücreye özgü Flex virüsüyle değiştirerek, ameliyat protokolünü değiştirmeden birkaç anatomik veya fizyolojik soruyu yanıtlayabilirsiniz.
