La asignación de circuitos asistidos por Channelrhodopsin es una técnica de precisión para el mapeo funcional de proyecciones neuronales de largo alcance. Aquí, mostramos cómo utilizar este enfoque para investigar circuitos en el tallo cerebral auditivo. En las rebanadas cerebrales, los axones de múltiples fuentes a menudo se entremezclan, lo que dificulta aislar las entradas individuales mediante estimulación eléctrica.
Mediante el uso de CRACM, esta limitación se puede superar. Encontrar lambda y definir constantemente el sistema de coordenadas estereotaxicas es un reto, al igual que mantener la duración del procedimiento corta. Tener todos los pasos cuidadosamente asignados aumentará su tasa de éxito.
Comience por rociar el área de la cirugía con 70%etanol para desinfectar y colocar cortinas de toalla estériles para cubrir el área de la cirugía. Retire la ropa de cama de la jaula para limitar el riesgo de asfixia de la jaula de recuperación. A continuación, coloque una almohadilla de calefacción debajo de la jaula y proporcione una fuente de alimentos y agua.
A continuación, transfiera el animal a un marco estereotaxico y continúe con la anestesia. Inserte una sonda de temperatura rectal y encienda el controlador de temperatura homeostático. Luego, aplica pomada oftálmica para evitar que los ojos se sequen.
Administrar analgésico preventivo. Por último, afeita el cuero cabelludo con pinzas eléctricas. Desinfectar el cuero cabelludo con tres hisopos alternos de yodo povidona y 70%etanol.
Comience la cirugía haciendo una incisión en el cuero cabelludo a lo largo de la línea media, comenzando entre las orejas y continuando rostral a los ojos, exponiendo las suturas lambda y bregma. Empuje la piel hacia un lado y retire el periosteo del hueso expuesto si es necesario. A continuación, marque la sutura lambda con un marcador quirúrgico, coloque la punta del nanoinyector para que esté tocando lambda y cero las coordenadas del micromanipulator.
Utilice la punta del nanoinyectores y el micromanibultor para medir la diferencia de elevación entre las suturas lambda y bregma. Ajuste la altura de la barra de paletas para que la expresión y el bregma sufibran a más o menos 100 micrómetros de altura. Mapear el lugar de inyección utilizando la punta del nanoinyectores y el sistema de coordenadas del micromanipador y marcar el sitio con un marcador quirúrgico.
A continuación, utilice un taladro micromotor con una rebaba de taladro de 0,5 milímetros para realizar una craneotomía sobre el lugar de inyección. Para asegurar una amplia transfección de las neuronas en el núcleo objetivo, utilice un nano-inyector para hacer inyecciones a varias profundidades en el tejido y en el caso de regiones cerebrales más grandes, como el colliículo inferior, hacer inyecciones en el transcurso de dos o más penetraciones en diferentes coordenadas X e Y. Para inyectar el colicóculo inferior, deposite 20 nanolitros de virus en los intervalos de 250 micrómetros a lo largo del eje Z entre 2, 250 micrómetros y 1, 750 micrómetros de profundidad.
Para las inyecciones en el núcleo coclear dorsal, depositar 20 nanolitros de virus a una profundidad de 4, 750 micrómetros y 4, 550 micrómetros respectivamente. Después de inyectar en cada coordenada Z, espere de dos a tres minutos antes de mover el inyector a la siguiente coordenada Z para permitir que el virus se difunda fuera del lugar de inyección, lo que reduce la probabilidad de que el virus sea aspirado por el tracto de inyección cuando se vuelva a colocar el nanoinyentador. Luego, después de la última inyección, espere de tres a cinco minutos antes de retraer el nanoinyector del cerebro.
Cuando el nano-inyector se retira del cerebro entre penetraciones y entre animales, expulse un pequeño volumen de virus de la punta para comprobar que la punta no se ha obstruido. Después de las inyecciones, utilice PBS estéril para mojar los bordes cortados del cuero cabelludo y luego mueva suavemente la piel hacia la línea media. Cierre la herida con suturas simples interrumpidas con suturas de nylon 6-0.
Luego, aplica de 0,5 a un mililitro de gelatina de 2%lidocaína a la herida. Retire las barras de las orejas y la sonda de temperatura, gire el isoflurano y retire al animal de la barra de paletas y transfiéralo a la jaula de recuperación. Por último, supervise la recuperación de cerca.
Una vez que el animal esté completamente despierto, moviéndose y sin mostrar signos de dolor o angustia, transfiera de nuevo a su jaula y devuelva la jaula a la vivarium. Utilice métodos de abrazadera de parche estándar para realizar grabaciones. Comience colocando la rebanada en una cámara de grabación bajo un microscopio vertical de etapa fija y profuso continuamente con líquido cefalorraquídeo artificial a dos mililitros por minuto.
A continuación, parchear las neuronas bajo control visual utilizando un amplificador de abrazadera de parche adecuado. Por último, durante las grabaciones al por mayor, active Chronos entregando breves pulsos de luz de 470 nanómetros o ChrimsonR mediante breves pulsos de luz de 580 nanómetros a través de LED disponibles en el mercado. Los resultados indicaron que la inyección de ChrimsonR condujo a una expresión fuerte en el DCN con fluorescencia tdTomato visible en células y fibras.
En la CPI contralateral, las fibras fuertemente etiquetadas con tdTomato eran claramente visibles después de tres semanas, demostrando la capacidad de tráfico de largo alcance de la construcción ChrimsonR-tdTomato cuando se inyecta en núcleos del tallo cerebral auditivo. La activación óptica de ChrimsonR provocó EPSP en neuronas VIP IC, lo que indica que ChrimsonR es una herramienta útil para experimentos CRACM de largo alcance cuando los parámetros experimentales exigen el uso de luz roja en lugar de luz azul. Sin embargo, encontramos que ChrimsonR se activó fácilmente con luz azul, mostrando el mismo umbral para la activación de la luz azul que Chronos.
Para este protocolo es más importante asegurarse de que las coordenadas estereotaxicas son correctas y confirmar que el virus se expresó sólo en su región cerebral objetivo. Al intercambiar el viroconstrucción De Chronos ChrimsonR con un virus diferente, por ejemplo, un virus Flex específico de la célula, puede responder a varias preguntas anatómicas o fisiológicas sin cambiar el protocolo de cirugía.
