La cartographie des circuits assistée par channelrhodopsine est une technique de précision pour la cartographie fonctionnelle des projections neuronales à longue portée. Ici, nous montrons comment utiliser cette approche pour étudier les circuits dans le tronc cérébral auditif. Dans les tranches de cerveau, les axones de sources multiples sont souvent mélangés, ce qui rend difficile l’isolement des entrées individuelles à l’aide de la stimulation électrique.
En utilisant cracm, cette limitation peut être surmontée. Trouver lambda et constamment définir le système de coordonnées stéréotaxiques est difficile, tout comme le maintien de la durée de la procédure courte. Avoir toutes les étapes soigneusement cartographiées augmentera votre taux de réussite.
Commencez par pulvériser la zone de chirurgie avec 70% d’éthanol pour assainir et placer des rideaux stériles de serviette pour couvrir la zone de chirurgie. Retirez la literie de cage pour limiter le risque d’asphyxie de la cage de récupération. Ensuite, placez un coussin chauffant sous la cage et fournissez une source de nourriture et d’eau.
Ensuite, transférez l’animal dans un cadre stéréotaxique et continuez l’anesthésie. Insérez une sonde de température rectale et allumez le contrôleur de température homéostatique. Ensuite, appliquez de l’onguent ophtalmique pour empêcher les yeux de se dessécher.
Administrer l’analgésique préemptif. Enfin, raser le cuir chevelu avec des tondeuses électriques. Désinfecter le cuir chevelu avec trois écouvillons alternatifs d’iode povidone et 70% d’éthanol.
Commencez la chirurgie en faisant une incision dans le cuir chevelu le long de la ligne médiane, en commençant entre les oreilles et en continuant rostral aux yeux, exposant les sutures lambda et bregma. Poussez la peau sur le côté et retirez le périoste de l’os exposé si nécessaire. Ensuite, marquer la suture lambda avec un marqueur chirurgical, positionner la pointe du nano-injecteur de sorte qu’il est juste toucher lambda et zéro les coordonnées micromanipulateur.
Utilisez la pointe nano-injecteur et le micromanipulateur pour mesurer la différence d’altitude entre les sutures lambda et bregma. Ajustez la hauteur de la barre de palette pour amener lambda et bregma à l’intérieur ou moins 100 micromètres de différence de hauteur. Cartographiez le site d’injection à l’aide de la pointe du nano-injecteur et du système de coordonnées du micromanipulateur et marquez le site à l’aide d’un marqueur chirurgical.
Ensuite, utilisez une perceuse micromotrice avec une bavure de forage de 0,5 millimètre pour effectuer une craniotomie sur le site d’injection. Pour assurer une transfection large des neurones dans le noyau cible, utilisez un nano-injecteur pour faire des injections à différentes profondeurs dans le tissu et dans le cas de plus grandes régions du cerveau, comme le colliculus inférieur, faire des injections au cours de deux pénétrations ou plus à différentes coordonnées X et Y. Pour injecter le colliculus inférieur, déposez 20 nanolitres de virus dans les intervalles de 250 micromètres le long de l’axe Z entre 2 250 micromètres et 1 750 micromètres de profondeur.
Pour les injections dans le noyau cochléaire dorsal, déposer 20 nanolitres de virus à une profondeur de 4 750 micromètres et 4 550 micromètres respectivement. Après l’injection à chaque coordonnée Z, attendez deux à trois minutes avant de déplacer l’injecteur vers la coordonnée Z suivante pour laisser le temps au virus de se diffuser loin du site d’injection, réduisant ainsi la probabilité que le virus soit aspiré dans le tractus d’injection lorsque le nano-injecteur est repositionné. Puis, après la dernière injection, attendez trois à cinq minutes avant de retirer le nano-injecteur du cerveau.
Lorsque le nano-injecteur est retiré du cerveau entre les pénétrations et entre les animaux, éjecter un petit volume de virus de la pointe pour vérifier que la pointe n’est pas obstruée. Après les injections, utiliser PBS stérile pour mouiller les bords coupés du cuir chevelu, puis déplacer doucement la peau vers la ligne médiane. Fermez la plaie avec de simples sutures interrompues à l’aide de sutures en nylon 6-0.
Ensuite, appliquez 0,5 à un millilitre de gelée de lidocaïne de 2% sur la plaie. Retirez les barres d’oreille et la sonde de température, tournez l’isoflurane et retirez l’animal de la barre de palette et transférez-le dans la cage de récupération. Enfin, surveillez de près la récupération.
Une fois que l’animal est complètement éveillé, se déplaçant et ne montrant aucun signe de douleur ou de détresse, transférez-le dans sa cage et retournez la cage au vivarium. Utilisez des méthodes standard de pince à patch pour faire des enregistrements. Commencez par placer la tranche dans une chambre d’enregistrement sous un microscope droit à stade fixe et profusez continuellement avec du liquide céphalo-rachidien artificiel à deux millilitres par minute.
Ensuite, patch neurones sous contrôle visuel à l’aide d’un amplificateur de pince patch approprié. Enfin, lors d’enregistrements en gros, activez Chronos en livrant de brèves impulsions de lumière de 470 nanomètres ou de ChrimsonR par de brèves impulsions de lumière de 580 nanomètres grâce à des LED disponibles dans le commerce. Les résultats ont indiqué que l’injection de ChrimsonR a mené à l’expression forte dans le DCN avec la fluorescence de tdTomato visible dans les cellules et les fibres.
Dans la CPI contralatérale, les fibres fortement étiquetées avec tdTomato étaient clairement visibles après trois semaines, démontrant la capacité de trafic à longue portée de la construction ChrimsonR-tdTomato lorsqu’elles sont injectées dans des noyaux auditifs de tige cérébrale. Activation optique des EPSP allongés ChrimsonR dans les neurones VIP IC, ce qui indique que ChrimsonR est un outil utile pour les expériences à longue portée cracm lorsque les paramètres expérimentaux exigent l’utilisation de la lumière rouge au lieu de la lumière bleue. Cependant, nous avons constaté que ChrimsonR a été facilement activé avec la lumière bleue, montrant le même seuil pour l’activation de la lumière bleue que Chronos.
Pour ce protocole, il est très important de s’assurer que les coordonnées stéréotaxiques sont correctes et de confirmer que le virus n’a été exprimé que dans votre région ciblée du cerveau. En échangeant le Chronos ChrimsonR viroconstruct avec un autre virus, par exemple, un virus Flex spécifique à une cellule, vous pouvez répondre à plusieurs questions anatomiques ou physiologiques sans modifier le protocole de chirurgie.
