מיפוי מעגלים בסיוע Channelrhodopsin הוא טכניקה מדויקת למיפוי פונקציונלי של תחזיות עצביות ארוכות טווח. כאן, אנו מראים כיצד להשתמש בגישה זו כדי לחקור מעגלים בגזע המוח השמיעתי. בפרוסות מוח, אקסונים ממקורות מרובים הם לעתים קרובות intermixed, מה שהופך אותו קשה לבודד כניסות בודדות באמצעות גירוי חשמלי.
באמצעות CRACM, ניתן להתגבר על מגבלה זו. מציאת lambda והגדרת מערכת הקואורדינטות הסטריאוטוקסית באופן עקבי היא מאתגרת כמו שמירה על משך ההליך קצר. לאחר כל השלבים ממופה בקפידה יגדיל את שיעור ההצלחה שלך.
התחילו בריסוס אזור הניתוח עם 70% אתנול לחיטוי והניחו וילונות מגבות סטריליים לכיסוי אזור הניתוח. הסר מצעים בכלוב כדי להגביל את הסיכון לחנק מכלוב ההחלמה. לאחר מכן, לשים כרית חימום מתחת לכלוב ולספק מקור מזון ומים.
לאחר מכן, מעבירים את החיה למסגרת סטריאוטוקסית וממשיכים בהרדמה. הכנס בדיקה בטמפרטורה רקטלית והתניף את בקר הטמפרטורה ההומוסטטי. לאחר מכן, להחיל משחה עיניים כדי למנוע עיניים להתייבש.
לנהל משכך כאבים מונע. לבסוף, לגלח את הקרקפת עם קוצץ חשמלי. לחטא את הקרקפת עם שלוש ספוגיות לסירוגין של יוד povidone ו 70% אתנול.
התחל ניתוח על ידי ביצוע חתך בקרקפת לאורך קו האמצע, החל בין האוזניים והמשך rostral לעיניים, חשיפת תפרים lambda ו bregma. לדחוף את העור לצד ולהסיר periosteum מהעצם החשופה במידת הצורך. לאחר מכן, לסמן את תפר lambda עם סמן כירורגי, למקם את הקצה של מזרק ננו, כך שהוא רק נוגע lambda ואפס את הקואורדינטות micromanipulator.
השתמש בקצה ננו מזרק micromanipulator כדי למדוד את ההבדל בגובה בין lambda ותפרים bregma. התאימו את גובה סרגל הצבעים כדי להביא את למבדה ובריגמה להפרש גובה פלוס או מינוס 100 מיקרומטר. מפה את אתר ההזרקה באמצעות קצה ננו מזרק מערכת קואורדינטות micromanipulator ולסמן את האתר עם סמן כירורגי.
לאחר מכן, השתמש במקדח מיקרו-מוטור עם מקדחה של 0.5 מילימטר כדי לבצע ניתוח גולגולתי מעל אתר ההזרקה. כדי להבטיח החלמה רחבה של נוירונים בגרעין היעד, השתמש בננו-מזרק כדי לבצע זריקות בעומקים שונים ברקמה ובמקומת אזורי מוח גדולים יותר, כמו הקוליקולוס הנחות, לבצע זריקות במהלך שתי חדירות או יותר בקואורדינטות X ו- Y שונות. כדי להזריק את הקוליקולוס הנחות, להפקיד 20 nanoliters של וירוס במרווחים של 250 מיקרומטר לאורך ציר Z בין 2, 250 מיקרומטר ו 1, 750 מיקרומטר עומק.
עבור זריקות בגרעין השבב הגבי, להפקיד 20 nanoliters של וירוס בעומק של 4, 750 מיקרומטר ו 4, 550 מיקרומטר בהתאמה. לאחר הזרקת בכל קואורדינטת Z, המתן שתיים עד שלוש דקות לפני העברת המזרק לתיאום Z הבא כדי לאפשר לנגיף להתפזר הרחק מאתר ההזרקה, מה שמקטין את ההסתברות שהווירוס יישאב את דרכי ההזרקה כאשר מזרק הננו ממוקם מחדש. לאחר מכן, לאחר הזריקה האחרונה, לחכות שלוש עד חמש דקות לפני נסיגת ננו מזרק מהמוח.
כאשר מזרק הננו מוסר מהמוח בין חדירות ובין בעלי חיים, להוציא נפח קטן של וירוס מהטיפ כדי לבדוק כי הקצה לא סתם. לאחר הזריקות, השתמש PBS סטרילי להרטיב את הקצוות החתוכים של הקרקפת ולאחר מכן בעדינות להזיז את העור בחזרה לכיוון קו האמצע. סגור את הפצע עם תפרים מופרעים פשוטים באמצעות 6-0 תפרים ניילון.
לאחר מכן, יש למרוח 0.5 על מיליליטר אחד של 2% ג'לי לידוקאין על הפצע. הסר את פסי האוזן ואת בדיקה טמפרטורה, להפוך isoflurane, ולהסיר את החיה מן סרגל הצבעים ולהעביר אותו לכלוב ההתאוששות. לבסוף, לפקח על התאוששות מקרוב.
ברגע שהחיה ערה לחלוטין, מסתובבת, ולא מראה סימנים של כאב או מצוקה, מעבירים אותה בחזרה לכלוב שלה ומחזירים את הכלוב לויבריום. השתמש בשיטות מהדק תיקון סטנדרטיות כדי לבצע הקלטות. התחל על ידי הנחת הפרוסה בתא הקלטה תחת מיקרוסקופ זקוף שלב קבוע ללא הרף בשפע עם נוזל השדרתי מלאכותי בשני מיליליטר לדקה.
לאחר מכן, תיקון נוירונים תחת שליטה חזותית באמצעות מגבר מהדק תיקון מתאים. לבסוף, במהלך הקלטות סיטונאיות, להפעיל Chronos על ידי אספקת פולסים קצרים של 470 ננומטר אור או ChrimsonR על ידי פולסים קצרים של 580 ננומטר אור באמצעות נורי זמין מסחרית. התוצאות הצביעו על כך שהזרקת ChrimsonR הובילה לביטוי חזק ב- DCN עם פלואורסצנטיות tdTomato הנראית בתאים ובסיבים.
בבית הדין הפלילי הבינלאומי, סיבים המסומן היטב עם tdTomato נראו בבירור לאחר שלושה שבועות, המדגימים את יכולת הסחר ארוך הטווח של מבנה ChrimsonR-tdTomato כאשר מוזרק לתוך גרעיני גזע המוח השמיעתי. הפעלה אופטית של ChrimsonR עוררה EPSPs בנוירונים VIP IC, המציין כי ChrimsonR הוא כלי שימושי עבור ניסויים ארוכי טווח CRACM כאשר הפרמטרים הניסיוניים דורשים שימוש באור אדום במקום באור כחול. עם זאת, מצאנו כי ChrimsonR הופעל בקלות עם אור כחול, מראה את אותו סף להפעלת אור כחול כמו Chronos.
עבור פרוטוקול זה חשוב ביותר לוודא כי הקואורדינטות הסטריאוטוקסיות נכונות ולאשר כי הנגיף בא לידי ביטוי רק באזור המוח הממוקד שלך. על ידי החלפת כרונוס ChrimsonR viroconstruct עם וירוס אחר, למשל, וירוס Flex ספציפי לתא, אתה יכול לענות על מספר שאלות אנטומיות או פיזיולוגיות מבלי לשנות את פרוטוקול הניתוח.
