Картирование цепи с помощью Channelrhodopsin является высокоточным методом функционального картирования нейронных проекций дальнего радиуса действия. Здесь мы покажем, как использовать этот подход для исследования схем в слуховой ствол мозга. В ломтиках мозга аксоны из нескольких источников часто перемешиваются, что затрудняет изоляцию отдельных входов с помощью электрической стимуляции.
С помощью CRACM это ограничение может быть преодолено. Поиск lambda и последовательное определение стереотаксисной системы координат является сложной задачей, как и сохранение продолжительности процедуры короткий. Имея все шаги тщательно наметили увеличит ваш успех.
Начните с распыления области хирургии с 70% этанола для дезинфекции и место стерильных штор полотенце для покрытия области хирургии. Удалите постельные принадлежности клетки, чтобы ограничить риск удушья из клетки восстановления. Затем положите грелку под клетку и предоставьте источник пищи и воды.
Затем перенесите животное в стереотаксис и продолжайте анестезию. Вставьте зонд прямой температуры и включите гомеостатический контроллер температуры. Затем нанесите офтальмологическую мазь, чтобы предотвратить высыхание глаз.
Администрирование упреждающего анальгетики. Наконец, побрить кожу головы с электрическими клиперами. Дезинфицировать кожу головы тремя чередующимися мазки йода повидоне и 70% этанола.
Начните операцию, сделав разрез на коже головы вдоль средней линии, начиная между ушами и продолжая ростральный глаза, подвергая швов лямбды и брегмы. Нажмите кожу в сторону и удалить periosteum из открытой кости, если это необходимо. Затем отметь шов ламбды хирургическим маркером, распоисти кончик нано-инжектора так, чтобы он просто касался ламбды и обнулял координаты микроманипулятора.
Используйте наконечник нано-инжектора и микроманипулятор для измерения разницы в высоте между швами лямбды и брегмы. Отрегулируйте высоту палитры бар довести lambda и bregma в пределах плюс-минус 100 микрометров разница в высоте. Наметите место инъекций с помощью наконечника нано-инжектора и системы координат микроманипулятора и отметйте участок хирургическим маркером.
Затем используйте микромоторную дрель с 0,5-миллиметровым буровым заусенцем для выполнения краниотомии над местом инъекции. Для обеспечения широкой трансфекции нейронов в ядре цели, используйте нано-инжектор, чтобы сделать инъекции на различных глубинах в ткани и в случае больших областей мозга, как нижний колликул, делать инъекции в течение двух или более проникновений в различных X и Y координат. Для введения низкого колликула, депозит 20 нанолитров вируса в интервалах 250 микрометров вдоль оси й между 2, 250 микрометров и 1, 750 микрометров глубины.
Для инъекций в спинное кохлеарное ядро откладывают 20 нанолитров вируса на глубине 4, 750 микрометров и 4, 550 микрометров соответственно. После введения в каждом координате, подождите две-три минуты, прежде чем переместить инжектор к следующей координате, чтобы позволить вирусу рассеяться от места инъекции, уменьшая вероятность того, что вирус будет всасывается в инъекционный тракт, когда нано-инжектор перемещается. Затем, после последней инъекции, подождите три-пять минут, прежде чем вывести нано-инжектор из мозга.
Когда нано-инжектор удаляется из мозга между проникновением и между животными, извлечь небольшой объем вируса из кончика, чтобы проверить, что кончик не засоряется. После инъекций используйте стерильный PBS, чтобы промокнуть края кожи головы, а затем осторожно переместить кожу обратно к средней линии. Закройте рану простыми прерванные швы с помощью 6-0 нейлоновых швов.
Затем нанесите на рану желе от 0,5 до одного миллилитра 2%лидокаина. Удалите ушные батончики и температурный зонд, поверните изофлюран, и удалите животное из палитры бар и передать его в клетку восстановления. Наконец, внимательно следите за восстановлением.
После того, как животное полностью проснулся, двигаясь вокруг, и не проявляя никаких признаков боли или бедствия, передать его обратно в клетку и вернуть клетку в вивариум. Используйте стандартные методы зажима патча, чтобы сделать записи. Начните с размещения ломтика в камере записи под фиксированной стадии вертикально микроскопа и постоянно обильные с искусственной спинномозговой жидкости на два миллилитров в минуту.
Далее, патч нейронов под визуальным контролем с помощью подходящего усилителя патч зажима. Наконец, во время оптовых записей, активировать Chronos путем доставки кратких импульсов 470 нанометров света или ChrimsonR краткими импульсами 580 нанометров света через коммерчески доступные светодиоды. Результаты показали, что инъекция ChrimsonR привела к сильному выражению в DCN с флуоресценцией tdTomato, видимой в клетках и волокнах.
В контралатеральной МЦК волокна, сильно помеченные tdTomato, были хорошо видны через три недели, демонстрируя возможности долгосрочной торговли конструкцией ChrimsonR-tdTomato при введении в слуховые ядра ствола мозга. Оптическая активация ChrimsonR elicted EPSPs в IC VIP нейронов, указывая, что ChrimsonR является полезным инструментом для дальних экспериментов CRACM, когда экспериментальные параметры требуют использования красного света вместо синего света. Тем не менее, мы обнаружили, что ChrimsonR был легко активирован с синим светом, показывая тот же порог для активации синего света, как Chronos.
Для этого протокола наиболее важно убедиться, что стереотаксис координаты являются правильными и подтвердить, что вирус был выражен только в вашей целевой области мозга. Обменявшись вирусоконструкцией Chronos ChrimsonR с другим вирусом, например, клеточным вирусом Flex, вы можете ответить на несколько анатомических или физиологических вопросов, не изменив протокол операции.
