رسم خرائط الدوائر بمساعدة Channelrhodopsin هو تقنية دقيقة لرسم الخرائط الوظيفية للإسقاطات العصبية طويلة المدى. هنا، نعرض كيفية استخدام هذا النهج للتحقيق في الدوائر في جذع الدماغ السمعي. في شرائح الدماغ، غالباً ما تكون المحاور من مصادر متعددة متشابكة، مما يجعل من الصعب عزل المدخلات الفردية باستخدام التحفيز الكهربائي.
باستخدام CRACM، يمكن التغلب على هذا القيد. العثور على لامدا وتحديد باستمرار نظام الإحداثيات stereotaxic هو التحدي كما هو الحفاظ على مدة الإجراء قصيرة. بعد أن كل الخطوات التي تم تعيينها بعناية سيزيد من معدل نجاحك.
تبدأ برش منطقة الجراحة مع 70٪ الإيثانول لتعقيم ووضع الستائر منشفة معقمة لتغطية منطقة الجراحة. إزالة الفراش قفص للحد من خطر الاختناق من قفص الانتعاش. بعد ذلك، ضع وسادة تدفئة تحت القفص وتوفير مصدر للغذاء والماء.
بعد ذلك، نقل الحيوان إلى إطار استريو واكمل التخدير. أدخل مسبار درجة حرارة المستقيم والتبديل على وحدة تحكم درجة الحرارة المثلية. ثم، وتطبيق مرهم العيون لمنع العينين من الجفاف.
إدارة مسكن وقائي. وأخيرا، حلق فروة الرأس مع مقصات كهربائية. تطهير فروة الرأس مع ثلاث مسحات بالتناوب من اليود povidone والإيثانول 70٪.
تبدأ عملية جراحية عن طريق إجراء شق في فروة الرأس على طول خط الوسط، بدءا بين الأذنين واستمرار الرسترال إلى العينين، وفضح الغرز لامدا وbregma. ادفع الجلد إلى الجانب وأزل الـ periosteum من العظام المكشوفة إذا لزم الأمر. المقبل، بمناسبة خياطة لامدا مع علامة جراحية، موقف غيض من نانو حاقن بحيث يكون مجرد لمس لامدا وصفر إحداثيات ميكرومانيبولاتور.
استخدام طرف نانو حاقن وmicromanipulator لقياس الفرق في الارتفاع بين الغرز لامدا وbregma. ضبط ارتفاع شريط لوحة لجلب لامدا وbregma إلى داخل زائد أو ناقص 100 ميكرومتر الارتفاع الفرق. خريطة موقع الحقن باستخدام طرف نانو حاقن ونظام تنسيق micromanipulator ووضع علامة على الموقع مع علامة جراحية.
ثم، استخدم حفر micromotor مع حفر 0.5 ملليمتر لإجراء عملية استئصال القحف على موقع الحقن. لضمان نقل الخلايا العصبية على نطاق واسع في النواة المستهدفة ، استخدم حقن نانو لإجراء الحقن في أعماق مختلفة في الأنسجة وفي حالة مناطق الدماغ الأكبر ، مثل الكوليكولو أدنى ، وجعل الحقن على مدى اثنين أو أكثر من الاختراقات في إحداثيات X و Y مختلفة. لحقن كوليكولوس أدنى، إيداع 20 نانولترات من الفيروس في فترات من 250 ميكرومتر على طول محور Z بين 2، 250 ميكرومتر و 1، 750 ميكرومتر عمق.
للحقن في نواة القوقعة الظهرية، قم بإيداع 20 نانويتلتر من الفيروس على عمق 4، 750 ميكرومتر و4، 550 ميكرومتر على التوالي. بعد الحقن في كل إحداثي Z، انتظر دقيقتين إلى ثلاث دقائق قبل نقل المحاقن إلى إحداثي Z التالي لإتاحة الوقت للفيروس لانتشار بعيدا عن موقع الحقن، مما يقلل من احتمال أن يتم امتصاص الفيروس حتى المسالك الحقن عندما يتم إعادة وضع حقن نانو. ثم، بعد الحقنة الأخيرة، انتظر ثلاث إلى خمس دقائق قبل سحب نانو حاقن من الدماغ.
عندما يتم إزالة حقن نانو من الدماغ بين الاختراقات وبين الحيوانات، وإخراج كمية صغيرة من الفيروس من طرف للتأكد من أن الطرف لم تسد. بعد الحقن، واستخدام برنامج تلفزيوني معقمة لبلل حواف قطع من فروة الرأس ومن ثم نقل بلطف الجلد مرة أخرى نحو خط الوسط. إغلاق الجرح مع الغرز انقطاع بسيطة باستخدام 6-0 خياطة النايلون.
ثم، تطبيق 0.5 إلى ملليلتر واحد من هلام 2٪ ليدوكاين إلى الجرح. إزالة أشرطة الأذن ومسبار درجة الحرارة، بدوره من ايزوفلوران، وإزالة الحيوان من شريط لوحة ونقله إلى قفص الانتعاش. وأخيرا، رصد الانتعاش عن كثب.
مرة واحدة الحيوان مستيقظا تماما، والتحرك حولها، وتظهر أي علامات الألم أو الضيق، ونقلها مرة أخرى إلى قفصه والعودة القفص إلى فيفاريوم. استخدام أساليب المشبك التصحيح القياسية لجعل التسجيلات. تبدأ من خلال وضع شريحة في غرفة تسجيل تحت مجهر مستقيم مرحلة ثابتة وافر باستمرار مع السائل النخاعي الاصطناعي في ملليلتر اثنين في الدقيقة.
المقبل, الخلايا العصبية التصحيح تحت السيطرة البصرية باستخدام مضخم المشبك التصحيح مناسبة. وأخيرا، أثناء التسجيلات بالجملة، قم بتنشيط كرونوس عن طريق تقديم نبضات قصيرة من 470 نانومتر خفيف أو ChrimsonR بواسطة نبضات قصيرة من 580 ضوء نانومتر من خلال مصابيح LED المتاحة تجاريا. وأشارت النتائج إلى أن حقن ChrimsonR أدى إلى التعبير القوي في DCN مع الفلوري tdTomato مرئية في الخلايا والألياف.
في ICC contralateral، كانت الألياف التي تحمل علامة قوية مع tdTomato مرئية بوضوح بعد ثلاثة أسابيع، مما يدل على قدرة الاتجار طويلة المدى من بناء ChrimsonR-tdTomato عندما حقنها في النوى الجذعية الدماغ السمعية. التنشيط البصري لChrimsonR epsps في الخلايا العصبية VIP IC، مما يشير إلى أن ChrimsonR هو أداة مفيدة لتجارب CRACM طويلة المدى عندما تتطلب المعلمات التجريبية استخدام الضوء الأحمر بدلا من الضوء الأزرق. ومع ذلك ، وجدنا أن ChrimsonR تم تنشيطه بسهولة مع الضوء الأزرق ، مما يظهر نفس العتبة لتنشيط الضوء الأزرق كما Chronos.
لهذا البروتوكول من المهم جدا للتأكد من أن إحداثيات stereotaxic صحيحة والتأكد من أن الفيروس تم التعبير عنها فقط في منطقة الدماغ المستهدفة. من خلال تبادل Chronos ChrimsonR viroconstruct مع فيروس مختلف، على سبيل المثال، خلية محددة فليكس الفيروس، يمكنك الإجابة على العديد من الأسئلة التشريحية أو الفسيولوجية دون تغيير بروتوكول الجراحة.
