活体和功能性鼠耳蜗毛细胞中的德特贴标签和吸收

该协议的总体目标是研究使用带功能机械传递通道的活发细胞中标有德州红的常规脱毛光。该技术的主要优点是，三千达克顿德州红德克斯特兰可用于评估活毛细胞中的机械传递通道功能。要收获耳蜗，请将产后六只小鼠的头骨放入含有莱博维茨的L-15培养的60毫米培养皿中，并使用手术剪刀从头骨的前部到头骨后部和外听觉管的表面上切开。

将皮肤折叠到鼻子上，露出颅骨，然后从头骨的背面和眼线上切开。将头骨分成两半，用一个小铲子取出大脑。当可以观察到时间骨骼时，用小剪刀在这些骨骼周围切割，以切除组织。

将含有新鲜 L-15 介质的 35 毫米培养皿中的时间骨骼淹没，将培养皿置于配备宽领域目镜和外部交流电流卤素光源的立体显微镜下。使用钳子去除周围的耳蜗组织、半圆形管和前庭器官。一旦耳蜗被解剖并放置在一个新的菜与新鲜的L-15介质，使用手术钳，使一个穿刺伤口在圆窗和一个穿刺在青形耳蜗区域。

当所有的耳蜗都收获后，将组织放入一个九井玻璃凹陷板的井中，其中含有200微升的新鲜L-15介质。对于分离组织的脱骨标记，用200微升新鲜L-15介质代替每个样品井中的介质，并辅以每毫升两毫克的荧光结合度。在室温下孵育样品两小时，在三维摇床中孵育25次旋转，倾斜角度为25度，不受光线影响。

在孵育结束时，用中洗涤组织一次，用HSS洗涤两分钟。第二次洗涤后，将样品在室温下在4%甲醛中固定30分钟，随后在HSSS中快速和温和地清洗两次。第二次洗涤后，使用细尖钳切除耳蜗骨、螺旋韧带和气管膜，并清洗HPSS中分离的科蒂器官。

取出透明电膜时要格外小心，因为头发细胞上的组织在这一步骤中很容易受损。要给F-actin贴上标签，在PBS中0.5%Triton X-100中渗透样品，并辅以100至200荧光标记的法洛丁稀释30分钟，在室温下不受光线影响。在孵育结束时，每次洗涤用新鲜HBSS清洗组织2至3次，随后在PBS中洗一次。

使用适当的安装介质将Corti组织器官安装到玻璃显微镜上，将头发立体膜面向上，并使用 63X 油浸入目标在荧光共体显微镜上成像样品。经过两个小时的孵育，与三千多克多克斯顿荧光结合得克萨斯红，科蒂器官从野生类型产后第六小鼠证明一个强大和特定的标签内和外毛细胞。对毛细胞立体膜和细胞体进行成像后发现，只有那些在细胞体中加入三千克达顿德xtran德州红的细胞也表现出其立体的荧光标记。

重要的是，沿立体灯观察均匀的荧光信号，在机械传输通道位于的较短的立体线尖端进行浓缩。在毛细胞和邻近支持细胞的细胞体中，也观察到囊泡状结构，这表明德xtran德州红也可以被内分泌。较大的10千达吨德克斯特兰也产生了一个囊泡状模式在细胞体的头发细胞和支撑细胞。

值得注意的是，钙溷合器或机械转导通道阻滞剂的存在可防止立体贴片标记和三千多克顿德xtran德州红在毛细胞中的吸收。然而，在机械传递通道封锁的情况下，仍然观察到囊泡样模式，表明这种吸收模式与功能性 MET 通道无关。在安装组织进行成像之前，仔细解剖Corti组织的器官并确认毛细胞的正确方向是非常重要的。

在活体和功能性毛细胞的脱毛标记后，可以对固定组织进行免疫污染，以确定感兴趣的特定细胞类型的蛋白质。