このプロトコルの全体的な目標は、機能的メカノトランスダクションチャネルを有する生毛細胞において、テキサスレッドで蛍光標識された規則的なデキストランの取り込みについて研究することです。この技術の主な利点は、3キロダルトンテキサスレッドデキストランが生きた毛細胞のメカノトランスダクションチャネル機能を評価するために使用できることです。内耳を収穫するには、出生後6日目のマウスの頭蓋骨をライボヴィッツのL-15培地を含む60ミリメートルの培養皿に入れ、外科用ハサミを使用して、前端から頭蓋骨の後端まで、そして外耳管を横切って表面的な切断を行う。
鼻に向かって皮膚を折り畳んで頭蓋骨を露出させ、後ろから頭蓋骨の前部とアイラインを横切って切開します。頭蓋骨を2つの半分に分け、小さなへらを使って脳を取り除く。側頭骨を観察できる場合は、小さいはさみを使ってこれらの骨の周りを切り取って組織を切除する。
新鮮なL-15培地を含む35ミリメートル皿に側頭骨を沈め、広いフィールド接眼眼と外部交流電流ハロゲン光源を備えたステレオ顕微鏡の下に皿を置きます。鉗子を使用して周囲の人工内耳組織、半円形の運河および前庭器官を取り除く。人工内耳が解剖され、新鮮なL-15メディアで新しい皿に入れられたら、外科的鉗子を使用して円形の窓に1つの穿刺傷を作り、尖体人工内耳領域で1つの穿刺を行う。
すべてのコクレアが収穫されたら、新鮮なL-15培地の200マイクロリットルを含む9ウェルガラスうつ病プレートの井戸に組織を入れます。単離組織のデキストラン標識の場合、各サンプルからの培地を、対象の蛍光共役デキストランの1ミリリットル当たり2ミリグラムを添加した新鮮なL-15培地の200マイクロリットルに置き換えます。光から保護された25度の傾いた角度で3次元シェーカーで、室温で2時間、毎分25回転のサンプルをインキュベートします。
インキュベーションの終了時に、1回、HBSSで1回、洗浄ごとに2分間、組織を洗浄します。2回目の洗浄後、室温で30分間4%パラホルムアルデヒドで試料を固定し、HBSSで2回の迅速かつ穏やかな洗浄を行います。2回目の洗浄後、細かい先端鉗子を使用して、人工内骨、螺旋靭帯、およびテクトリアル膜を除去し、HBSSでコルティの単離された器官を洗浄する。
このステップ中に毛髪細胞の組織が損傷しやすいので、透明なテクトリアル膜を除去する際には、細心の注意を払ってください。F-アクチンを標識するには、蛍光標識ファロイジンを100~200希釈してPBS中の0.5%トリトンX-100で透過して、光から保護された室温で30分間透過させます。インキュベーションの終わりに、PBSで1回の洗浄を行い、その後に示すように、洗浄ごとに新鮮なHBSSで組織を2〜3回洗浄します。
適切な取り付け媒体を使用して、コルチ組織の器官をガラス顕微鏡に取り付け、毛髪の立体層をスライドさせ、63X油浸出目的を使用して蛍光共焦点顕微鏡でサンプルを画像化します。テキサスレッドと蛍光結合した3キロダルトンデキストランによる2時間のインキュベーションの後、6匹のマウスの野生型からコルチ外植の器官は、内側と外側の両方の毛細胞の堅牢で特異的な標識を示す。毛細胞の立体および細胞体の画像化は、細胞体に3キロダルトンデキストランテキサスレッドを組み込んだ細胞だけが、ステレオシリアの蛍光標識を実証したことを明らかにした。
重要なことに、メカノトランスダクションチャネルが位置する短い立体列の先端で、高濃縮を伴うステレオシリアに沿って均一な蛍光信号が観察される。毛髪細胞の細胞体および隣接する支持細胞におけるベシクル様構造も観察され、デキストランテキサスレッドもエンドサイトーシスによって取り上げられることを示唆している。より大きな10キロダルトンデキtransはまた、毛細胞および支持細胞の細胞体に小胞様なパターンを産生した。
特に、カルシウムキレートまたはメカノトランスダクションチャネルブロッカーの存在は、毛細胞における立体標識および3キロダルトンデキストランテキサスレッドの取り込みを防ぐ。しかし、小胞様パターンはメカノトランスダクションチャネル遮断の存在下でまだ観察され、しかし、この取り込みのパターンは機能的なMETチャネルとは無関係であることを示している。皮質細胞の臓器を慎重に解剖し、画像処理のために組織を取り付ける前に毛細胞の適切な配向を確認することは非常に重要です。
生きた毛髪細胞および機能的な毛髪細胞のデキストラン標識後、固定組織の免疫染色を行い、目的のタンパク質の特定の細胞タイプを同定することができる。
