El objetivo general de este protocolo es estudiar la absorción de dextrán regularmente etiquetados fluorescentemente con Texas Red en células pilosas vivas con canales funcionales de mecanotransducción. La principal ventaja de esta técnica es que el dextrán de tres kilodalton Texas Red se puede utilizar para evaluar la función del canal de mecanotransducción en células pilosas vivas. Para cosechar la cóclea, coloque el cráneo de un ratón de seis días postnatales en un plato de cultivo de 60 milímetros que contenga el medio L-15 de Leibovitz y use tijeras quirúrgicas para hacer un corte superficial desde el extremo anterior hasta el extremo posterior del cráneo y a través de los canales auditivos externos.
Dobla la piel hacia la nariz para exponer el cráneo y haz una incisión desde la parte posterior hasta la parte delantera del cráneo y a través de la línea del ojo. Separe el cráneo en dos mitades y use una pequeña espátula para extirpar el cerebro. Cuando se puedan observar los huesos temporales, utilice tijeras pequeñas para cortar alrededor de estos huesos para extirpar el tejido.
Sumerja los huesos temporales en el plato de 35 milímetros que contiene el medio L-15 fresco y coloque el plato bajo un microscopio estéreo equipado con un ocular de campo ancho y una fuente de luz halógena de corriente alterna externa. Utilice fórceps para extraer el tejido coclear circundante, los canales semicirculares y los órganos vestibulares. Una vez que la cóclea ha sido diseccionada y colocada en un nuevo plato con medios frescos L-15, utilice fórceps quirúrgicos para hacer una herida punzante en la ventana redonda y una punción en la región coclear apical.
Cuando se hayan cosechado todas las cócleas, coloque el tejido en un pozo de una placa de depresión de vidrio de nueve pozos que contenga 200 microlitros de medio L-15 fresco. Para el etiquetado de dextrán de los tejidos aislados, reemplace el medio de cada pozo de muestra por 200 microlitros de medio L-15 fresco complementado con dos miligramos por mililitro del dextrano conjugado de fluorescencia de interés. Incubar las muestras durante dos horas a temperatura ambiente y 25 rotaciones por minuto en un agitador tridimensional en un ángulo inclinado de 25 grados protegido de la luz.
Al final de la incubación, lave los tejidos una vez con medio y una vez con HBSS durante dos minutos por lavado. Después del segundo lavado, fijar las muestras en 4%paraformaldehído durante 30 minutos a temperatura ambiente seguido de dos lavados rápidos y suaves en HBSS. Después del segundo lavado, utilice fórceps de punta fina para extraer el hueso coclear, el ligamento espiral y la membrana tectorial y lavar el órgano aislado de Corti en HBSS.
Tenga especial cuidado al extraer la membrana tectorial transparente ya que el tejido de las células pilosas puede dañarse fácilmente durante este paso. Para etiquetar la F-actina, permeabilizar las muestras en 0.5%Triton X-100 en PBS complementado con 100 a 200 dilución de faloide con etiqueta fluorescente durante 30 minutos a temperatura ambiente protegida de la luz. Al final de la incubación, lave los tejidos de dos a tres veces en HBSS fresco por lavado, como se demuestra seguido de un solo lavado en PBS.
Utilice un medio de montaje adecuado para montar el órgano de los tejidos Corti en un microscopio de vidrio, deslice los lados de la estereocía del cabello e imagine las muestras en un microscopio confocal fluorescente utilizando el objetivo de inmersión de aceite 63X. Después de una incubación de dos horas con tres kilodalton dextran conjugados fluorescentemente con Texas Red, órgano de Corti explant de tipo salvaje postnatal día seis ratones demuestran un etiquetado robusto y específico de las células del cabello interior y exterior. Las imágenes de la estereocilia de las células pilosas y los cuerpos celulares revelan que sólo aquellas células que han incorporado tres kilodalton dextran Texas Red en su cuerpo celular también demostraron el etiquetado fluorescente de su estereocilia.
Es importante destacar que se observa una señal fluorescente uniforme a lo largo de la estereocilia con enriquecimiento en las puntas de las filas estereocilias más cortas donde se encuentra el canal de mecanotransducción. También se observan estructuras similares a las vesículas en el cuerpo celular de las células pilosas y las células auxiliares vecinas, lo que sugiere que dextran Texas Red también puede ser tomado por endocitosis. Más grande 10 kilodalton dextrans también produjo un patrón similar a la vesícula en el cuerpo celular de las células pilosas y las células de apoyo.
En particular, la presencia de un quelante de calcio o bloqueadores de canales de mecanotransducción previene el etiquetado de estereocilias y la absorción de tres kilodalton dextran Texas Red en las células pilosas. El patrón similar a la vesícula todavía se observa en presencia de bloqueo del canal de mecanotransducción, sin embargo, lo que indica que este patrón de absorción es independiente de los canales funcionales del MET. Es muy importante diseccionar cuidadosamente el órgano del tejido Corti y confirmar la orientación adecuada de las células pilosas antes de montar el tejido para la toma de imágenes.
Después del etiquetado de dextrán de las células pilosas vivas y funcionales, se puede realizar una inmunosumanidad del tejido fijo para identificar tipos celulares específicos de proteínas de interés.
