L’objectif global de ce protocole est d’étudier l’absorption de dextran régulier étiqueté fluorescent avec Texas Red dans les cellules cils vivantes avec des canaux de mécanotransduction fonctionnelle. Le principal avantage de cette technique est que les trois kilodalton Texas Red dextran peuvent être utilisés pour évaluer la fonction du canal de mécanotransduction dans les cellules cils vivantes. Pour récolter la cochlée, placez le crâne d’une souris postnatale de six jours dans un plat de culture de 60 millimètres contenant le milieu L-15 de Leibovitz et utilisez des ciseaux chirurgicaux pour faire une coupe superficielle de l’extrémité antérieure à l’extrémité postérieure du crâne et à travers les canaux auditifs externes.
Pliez la peau vers le nez pour exposer le crâne et faire une incision de l’arrière à l’avant du crâne et à travers la ligne des yeux. Séparez le crâne en deux moitiés et utilisez une petite spatule pour enlever le cerveau. Lorsque les os temporels peuvent être observés, utilisez de petits ciseaux pour couper autour de ces os pour exciser le tissu.
Submergez les os temporels dans le plat de 35 millimètres contenant du L-15 frais moyen et placez le plat sous un microscope stéréo équipé d’un oculaire large champ et d’une source de lumière halogène alternée externe. Utilisez des forceps pour enlever le tissu cochléaire environnant, les canaux semi-circulaires et les organes vestibulaires. Une fois que la cochlée a été disséquée et placée dans un nouveau plat avec les médias frais de L-15, utilisez des forceps chirurgicaux pour faire une blessure de perforation sur la fenêtre ronde et une ponction à la région cochléaire apical.
Lorsque toutes les cochlées ont été récoltées, placez le tissu dans un puits d’une plaque de dépression en verre de neuf puits contenant 200 microlitres de L-15 frais moyen. Pour l’étiquetage dextran des tissus isolés, remplacez le milieu de chaque puits d’échantillon par 200 microlitres de L-15 frais moyen complété par deux milligrammes par millilitre de la fluorescence conjuguée dextran d’intérêt. Incuber les échantillons pendant deux heures à température ambiante et 25 rotations par minute dans un shaker tridimensionnel à un angle incliné de 25 degrés protégé de la lumière.
À la fin de l’incubation, laver les tissus une fois à l’heure moyenne et une fois avec le HBSS pendant deux minutes par lavage. Après le deuxième lavage, fixer les spécimens en paraformaldéhyde à 4 % pendant 30 minutes à température ambiante, suivi de deux lavages rapides et doux dans le HBSS. Après le deuxième lavage, utilisez des forceps à pointe fine pour enlever l’os cochléaire, le ligament spirale et la membrane tectoriale et laver l’organe isolé de Corti dans HBSS.
Prenez un soin supplémentaire lors de l’enlèvement de la membrane tectorial transparente puisque le tissu sur les cellules cils peuvent être facilement endommagés au cours de cette étape. Pour étiqueter la F-actine, perméabilizez les échantillons dans 0,5%Triton X-100 en PBS complété par 100 à 200 dilution de phalloidin étiqueté fluorescent pendant 30 minutes à température ambiante protégée de la lumière. À la fin de l’incubation, lavez les tissus deux à trois fois dans le HBSS frais par lavage tel que démontré suivi d’un seul lavage dans PBS.
Utilisez un support de montage approprié pour monter l’organe des tissus Corti sur le microscope en verre glisse stéréocilia cheveux vers le haut et l’image des échantillons sur un microscope confocal fluorescent en utilisant l’objectif d’immersion d’huile 63X. Après une incubation de deux heures avec trois kilodalton dextran conjugués fluorescentement avec Texas Red, organe de Corti explant de type sauvage postnatal jour six souris démontrent un étiquetage robuste et spécifique des cellules capillaires intérieures et externes. L’imagerie des cellules capillaires stéréocilia et des corps cellulaires révèle que seules les cellules qui ont incorporé trois kilodaltons dextran Texas Red dans leur corps cellulaire ont également démontré l’étiquetage fluorescent de leur stéréocilia.
Fait important, un signal fluorescent uniforme est observé le long de la stéréocilia avec enrichissement à l’extrémité des rangées stéréocilia plus courtes où se trouve le canal de mécanotransduction. Des structures vésicules dans le corps cellulaire des cellules cils et les cellules voisines de soutien sont également observées suggérant que dextran Texas Red peut également être pris par endocytose. Plus grand dextrans de 10 kilodalton a également produit un modèle vesicle-like dans le corps cellulaire des cellules de cheveux et des cellules de soutien.
Notamment, la présence d’un chélateur de calcium ou de inhibiteurs de la mécanotransduction empêche l’étiquetage stéréocilia et l’absorption de trois kilodaltons dextran Texas Red dans les cellules cils. Le modèle vesicle-like est toujours observé en présence du blocus de canal de méchanotransduction, cependant, indiquant que ce modèle d’absorption est indépendant des canaux fonctionnels de MET. Il est très important de disséquer soigneusement l’organe du tissu corti et de confirmer l’orientation correcte des cellules cils avant de monter le tissu pour l’imagerie.
Après l’étiquetage dextran des cellules cils vivantes et fonctionnelles, l’immunostaining du tissu fixe peut être exécuté pour identifier des types spécifiques de cellules de protéines d’intérêt.
