Bu protokolün genel amacı fonksiyonel mekanotransdüksiyon kanalları ile canlı saç hücrelerinde Texas Red ile etiketlenmiş düzenli dekstran floresan alımı incelemektir. Bu tekniğin en büyük avantajı üç kilodalton Texas Red dextran canlı saç hücrelerinde mechanotransdüksiyon kanal fonksiyonu değerlendirmek için kullanılabilir olmasıdır. Kokleayı hasat etmek için, doğum sonrası altı farenin kafatasını Leibovitz'in L-15 ortamını içeren 60 milimetrelik bir kültür yemeğine yerleştirin ve kafatasının arka ucuna ve dış işitsel kanallarboyunca ön uçtan yüzeysel bir kesim yapmak için cerrahi makas kullanın.
Kafatası ortaya çıkarmak için burun doğru deri katlayın ve kafatasının ön ve göz hattı boyunca arka dan bir kesi yapmak. Kafatasını iki yarıya ayırın ve beyni çıkarmak için küçük bir spatula kullanın. Zamansal kemikler gözlemlenebilir zaman, doku çıkarmak için bu kemiklerin etrafında kesmek için küçük makas kullanın.
Taze L-15 orta içeren 35 milimetrelik çanak temporal kemikleri batırın ve geniş bir alan gözlük ve harici alternatif akım halojen ışık kaynağı ile donatılmış bir stereo mikroskop altında çanak yerleştirin. Çevredeki koklear doku, yarım dairesel kanallar ve vestibüler organları kaldırmak için forceps kullanın. Koklea kesildikten ve taze L-15 media ile yeni bir tabağa yerleştirildikten sonra, yuvarlak pencerede bir delik yara ve apikal koklear bölgede bir delik yapmak için cerrahi forseps kullanın.
Tüm kokleae hasat edildiğinde, taze L-15 orta 200 mikrolitre içeren dokuz kuyulu cam depresyon plaka bir kuyu içine doku yerleştirin. İzole dokuların dekstran etiketleme için, floresan konjuge dextran mililitre başına iki miligram ile takviye taze L-15 orta 200 mikrolitre ile iyi her örnekten orta değiştirin. Numuneleri oda sıcaklığında iki saat ve ışıktan korunan 25 derecelik eğimli bir açıyla üç boyutlu bir çalkalayıcıda dakikada 25 dönüş için kuluçkaya yatırın.
Kuluçka sonunda, dokuları orta ve bir kez hbss ile yıkama başına iki dakika yıkayın. İkinci yıkamadan sonra numuneleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca %4 paraformaldehit ve ardından HBSS'de iki hızlı ve nazik yıkama ile düzeltin. İkinci yıkamadan sonra koklear kemiği, spiral ligamenti ve tektorial membranı çıkarmak ve HBSS'de Corti'nin izole organını yıkamak için ince uçlu çertikler kullanın.
Saç hücrelerindeki doku bu adımda kolayca zarar görebildiği için şeffaf tektorial membranı çıkarırken ekstra özen. F-aktin etiketlemek için, pbs içinde 0.5% Triton X-100 içinde floresan phalloidin 100 ila 200 seyreltme ile desteklenen örnekleri permeabilize oda sıcaklığında 30 dakika boyunca ışıktan korunan. Kuluçka sonunda, pbs tek bir yıkama ardından gösterildiği gibi yıkama başına taze HBSS dokuları 2-3 kez yıkayın.
Corti dokularının organını cam mikroskop üzerine monte etmek için uygun bir montaj ortamı kullanın saç stereocilia yanları yukarı yaslanır ve 63X yağ daldırma hedefini kullanarak örnekleri floresan konfokal mikroskobun üzerinde görüntüleyin. Texas Red ile konjuge üç kilodalton dekstran floresan ile iki saatlik bir kuluçka sonra, yabani tip postnatal gün altı fareler Corti explant organı hem iç hem de dış saç hücrelerinin sağlam ve özel etiketleme göstermektedir. Saç hücresi stereocilia ve hücre organlarının görüntüleme sadece kendi hücre vücudunda üç kilodalton dextran Texas Red dahil olan bu hücrelerin de stereocilia floresan etiketleme gösterdi ortaya koymaktadır.
Daha da önemlisi, mechanotransdüksiyon kanalının bulunduğu kısa stereositif sıraların uçlarında zenginleştirme ile stereosita boyunca tek tip floresan sinyal gözlenir. Saç hücrelerinin hücre vücudunda vezikül benzeri yapılar ve komşu destek hücreleri de dextran Texas Red de endositon tarafından alınabilir düşündüren gözlenmiştir. Daha büyük 10 kilodalton dekstrans da saç hücreleri ve destekleyen hücrelerin hücre vücudunda vezikül benzeri bir desen üretti.
Özellikle, bir kalsiyum şelatör veya mekotransdüksiyon kanal blokerleri varlığı stereocilia etiketleme ve saç hücrelerinde üç kilodalton dextran Texas Red alımını önler. Vezikül benzeri desen hala mechanotransdüksiyon kanalı abluka varlığında gözlenen, ancak, alım bu desen fonksiyonel MET kanalları bağımsız olduğunu gösteren. Corti dokusunun organını dikkatle incelemek ve görüntüleme için doku monte etmeden önce saç hücrelerinin doğru yönünü doğrulamak çok önemlidir.
Canlı ve fonksiyonel saç hücrelerinin dekstran etiketleme sonra, sabit doku immünboyama ilgi proteinlerin belirli hücre türlerini belirlemek için yapılabilir.
