Общая цель этого протокола заключается в изучении поглощения регулярных декстран флуоресцентно помечены Техас Красный в живых волосковых клеток с функциональными каналами механотрансдукции. Основным преимуществом этой техники является то, что три килодалтона Texas Red dextran могут быть использованы для оценки функции механотрансдукционных каналов в живых волосяных клетках. Чтобы собрать улитку, поместите череп послеродовой день шесть мыши в 60 миллиметров культуры блюдо, содержащее L-15 среды Лейбовица и использовать хирургические ножницы, чтобы сделать поверхностный разрез от переднего конца до заднего конца черепа и через внешние слуховые каналы.
Сложите кожу к носу, чтобы разоблачить череп и сделать разрез от задней части до передней части черепа и через линию глаза. Разделить череп на две половины и использовать небольшой шпатель, чтобы удалить мозг. Когда височные кости можно наблюдать, используйте небольшие ножницы, чтобы разрезать вокруг этих костей, чтобы акциз ткани.
Погрузите височные кости в 35-миллиметровую тарелку, содержащую свежую среду L-15, и поместите блюдо под стерео микроскоп, оснащенный широким полевым окуляром и внешним чередующимся источником галогенного света. Используйте типсы для удаления окружающих кохлеарных тканей, полукруглых каналов и вестибулярных органов. После того, как улитка была вскрыта и помещена в новое блюдо со свежими L-15 сми, использовать хирургические типсы, чтобы сделать один прокол раны на круглое окно и один прокол в апической кохлеарный регион.
Когда все улитки были собраны, поместите ткань в колодец из девяти хорошо стеклянной пластины депрессии, содержащей 200 микролитров свежей L-15 среды. Для декстранной маркировки изолированных тканей замените среду из каждого образца хорошо с 200 микролитров свежей L-15 среды дополнены двумя миллиграммами на миллилитр флуоресценции конъюгированных декстран интереса. Инкубировать образцы в течение двух часов при комнатной температуре и 25 оборотов в минуту в трехмерном шейкере под наклонным углом 25 градусов, защищенном от света.
В конце инкубации, мыть ткани один раз со средним и один раз с HBSS в течение двух минут за стирку. После второй стирки, исправить образцы в 4%paraformaldehyde в течение 30 минут при комнатной температуре следуют два быстрых и нежных моет в HBSS. После второй стирки используйте тонкие миппы кончика, чтобы удалить кохлеарную кость, спиральную связку и текториальную мембрану и промыть изолированный орган Корти в HBSS.
Будьте особенно заботы при удалении прозрачной текторной мембраны, так как ткань на волосковых клетках может быть легко повреждена во время этого шага. Чтобы маркировать F-актин, пронизывают образцы в 0.5%Triton X-100 в PBS дополнены от 100 до 200 разбавления флуоресцентно помечены фаллоидин в течение 30 минут при комнатной температуре защищены от света. В конце инкубации, мыть ткани два-три раза в свежем HBSS за стирку, как попродемонстрировано следуют одной стирки в PBS.
Используйте соответствующую монтажную среду для установки органа тканей Корти на стеклянный микроскоп слайды волос стереоцилия сторон вверх и изображение образцов на флуоресцентный конфокальный микроскоп с помощью 63X цели погружения масла. После двухчасовой инкубации с трехкилограммовым декстраном флуоресцентно спрягается с Texas Red, орган Corti explant из дикого типа послеродового дня шесть мышей демонстрируют надежную и специфическую маркировку как внутренних, так и внешних волосковых клеток. Изображение стереоцилии волосяных клеток и клеточных тел показывает, что только те клетки, которые включили три килодальтон dextran Texas Red в их клеточном теле, также продемонстрировали флуоресцентную маркировку их стереоцилии.
Важно отметить, что единый флуоресцентный сигнал наблюдается вдоль стереоцилии с обогащением на кончиках коротких стереоцилий рядов, где находится канал механотрансдукции. Vesicle-как структуры в клеточном теле волосковых клеток и соседних вспомогательных клеток также наблюдается предполагая, что декстран Техас Красный также может быть принято эндоцитоз. Большие 10 килодальтон dextrans также производится пузырьков, как картина в клеточном теле волосковых клеток и вспомогательных клеток.
Примечательно, что наличие хелатора кальция или блокаторов механотрансдукционного канала предотвращает маркировку стереоцилий и поглощение трех килодальтонного декстрана Texas Red в волосяных клетках. Однако везикулярная модель по-прежнему наблюдается при наличии блокады канала механотрансдукции, что указывает на то, что эта модель поглощения не зависит от функциональных каналов MET. Очень важно тщательно вскрыть орган ткани Корти и подтвердить правильную ориентацию волосковых клеток перед монтажом ткани для визуализации.
После декстранной маркировки живых и функциональных волосковых клеток, иммуностеть фиксированной ткани может быть выполнена для выявления конкретных типов клеток белков, представляющих интерес.
