O objetivo geral deste protocolo é estudar a absorção de dextran regular fluorescentemente rotulado com Texas Red em células ciliadas vivas com canais funcionais de mecanotransdução. A principal vantagem dessa técnica é que o dextran vermelho de três kilodalton texas pode ser usado para avaliar a função do canal de mecanotransdução em células ciliar vivas. Para colher a cóclea, coloque o crânio de um rato de seis dias pós-natal em um prato de cultura de 60 milímetros contendo o meio L-15 de Leibovitz e use uma tesoura cirúrgica para fazer um corte superficial da extremidade anterior até a extremidade posterior do crânio e através dos canais auditivos externos.
Dobre a pele em direção ao nariz para expor o crânio e faça uma incisão da parte de trás para a frente do crânio e através da linha dos olhos. Separe o crânio em duas metades e use uma pequena espátula para remover o cérebro. Quando os ossos temporais podem ser observados, use pequenas tesouras para cortar em torno desses ossos para extirpara o tecido.
Submergir os ossos temporais na antena de 35 milímetros contendo meio L-15 fresco e coloque o prato sob um microscópio estéreo equipado com uma ocular de campo largo e uma fonte externa de luz halógena de corrente alternada. Use fórceps para remover o tecido coclear circundante, canais semi-circulares e órgãos vestibulares. Uma vez que a cóclea tenha sido dissecada e colocada em um novo prato com mídia L-15 fresca, use fórceps cirúrgicos para fazer uma perfuração na janela redonda e uma punção na região coclear apical.
Quando toda a cóclea tiver sido colhida, coloque o tecido em um poço de uma placa de depressão de vidro de nove poços contendo 200 microliters de meio L-15 fresco. Para rotulagem dextran dos tecidos isolados, substitua o meio de cada amostra bem por 200 microliters de meio L-15 fresco suplementado com dois miligramas por mililitro da fluorescência conjugada dextran de interesse. Incubar as amostras por duas horas à temperatura ambiente e 25 rotações por minuto em um agitador tridimensional em um ângulo inclinado de 25 graus protegido da luz.
No final da incubação, lave os tecidos uma vez com média e uma vez com HBSS por dois minutos por lavagem. Após a segunda lavagem, fixar os espécimes em 4% de paraformaldeído por 30 minutos em temperatura ambiente, seguido por duas lavagens rápidas e suaves no HBSS. Após a segunda lavagem, use fórceps finos para remover o osso coclear, o ligamento espiral e a membrana tectorial e lavar o órgão isolado de Corti no HBSS.
Tome cuidado extra ao remover a membrana tectorial transparente, uma vez que o tecido nas células ciliares pode ser facilmente danificado durante esta etapa. Para rotular a F-actina, permeabilize as amostras em 0,5% Triton X-100 em PBS complementado com diluição de 100 a 200 de fhalloidina fluorescente por 30 minutos à temperatura ambiente protegida da luz. No final da incubação, lave os tecidos duas a três vezes em HBSS fresco por lavagem, como demonstrado seguido de uma única lavagem em PBS.
Use um meio de montagem apropriado para montar o órgão de tecidos Corti em microscópio de vidro desliza estereócilia capilar para cima e imagem as amostras em um microscópio confocal fluorescente usando o objetivo de imersão de óleo 63X. Após uma incubação de duas horas com três kilodalton dextran fluorescentemente conjugados com Texas Red, órgão de Corti explante do tipo selvagem pós-natal dia seis camundongos demonstram uma rotulagem robusta e específica de células ciliadas internas e externas. Imagens da estereócilia das células ciliadas e corpos celulares revelam que apenas as células que incorporaram três kilodalton dextran Texas Red em seu corpo celular também demonstraram rotulagem fluorescente de suas estereócilias.
É importante ressaltar que um sinal fluorescente uniforme é observado ao longo da estereócilia com enriquecimento nas pontas das linhas estereócilias mais curtas onde o canal de mecanotransdução está localizado. Estruturas semelhantes a vesículas no corpo celular das células ciliadas e nas células de apoio vizinhas também são observadas sugerindo que o Dextran Texas Red também pode ser tomado por endocitose. Dextrans maiores de 10 quilodaltons também produziu um padrão semelhante à vesícula no corpo celular das células ciliárias e células de suporte.
Notavelmente, a presença de um cortador de canais de chelador de cálcio ou mecanotransdução impede a rotulagem de estereócilia e a absorção de três kilodalton dextran Texas Red em células ciliadas. O padrão semelhante à vesícula ainda é observado na presença de bloqueio de canais de mecanotransdução, no entanto, indicando que esse padrão de absorção é independente dos canais MET funcionais. É muito importante dissecar o órgão do tecido Corti cuidadosamente e confirmar a orientação adequada das células ciliares antes de montar o tecido para a imagem.
Após a rotulagem dextran de células ciliar vivas e funcionais, a imunostenção do tecido fixo pode ser realizada para identificar tipos celulares específicos de proteínas de interesse.
