该协议描述了与抗体同时富集多个PTM的新技术，然后进行数据独立采集质谱分析，以获得对位点定位和相声的生物洞察。这是一种具有时间和成本效益的技术，能够同时识别和定量多肽，切片含有乙酸和吸碱PTM，只有少量的样品输入。跟踪翻译后修改是描述和防治不同疾病状态的重要步骤。
我们已经知道，某些癌症和糖尿病通过这些蛋白质的修饰受到高度控制。该方法理论上可应用于任何具有富集抗体的PTM，如泛化、磷酸化等。它也可以应用于其他组织类型或细胞培养模型。
使用此技术获取有价值的数据的关键是可重复性。这可以通过确保所有步骤非常仔细地执行，特别是涉及抗体珠的步骤来实现。首先，获取含有C18树脂的墨盒，这些树脂结合到高达10毫克的蛋白质。
将这些墨盒安装到真空装置中。在19.8%的水中加入800微升80%乙酰酸和0.2%甲酸，开始真空吸气，将液体拉过。重复此步骤一次，避免完全干燥墨盒。
通过真空吸附在水中加入 800 微升 0.2% 甲酸，使墨盒与墨盒进行均衡。重复两次。将一毫克多肽在约1000微升溶液中装到真空吸气的墨盒上。
在真空吸水下用800微升0.2%的甲酸洗涤两次肽。然后在每个墨盒下方排列 1.5 毫升微离心管，以收集肽。在真空吸气下，首先从墨盒中去除800微升的80%乙酰酸和0.2%的甲酸，在19.8%的水中，然后用400微升相同的溶液。
在真空浓缩器中完全干燥脱盐肽样品两到三个小时。现在，将干燥的肽重新在1.4毫升的冷1X免疫仿纯缓冲液中重新填充。涡流混合，确保pH值约为7。
将样品以10，000倍g离心，在4摄氏度下10分钟。出现一个小颗粒。在准备抗体珠时，将肽放在冰上。
将一毫升冷1X PBS加入含有100微升K-乙酰抗体珠浆的管子和含有100微升K-succinyl抗体珠浆的管子，通过移液混合。将整个溶液转移到新的 1.5 毫升管中，并在微型离心机中旋转 30 秒，在室温下。吸气PBS小心，避免吸走任何珠子。
重复洗涤三次。接下来，将珠子重新在大约440微升PBS中重新发送。移液珠子几次混合好。
使用200微升预切技巧，将每个乙酰氨酸抗体珠和苏辛利氨酸抗体珠的100微升转移到一个新的管中。在微型离心机中旋转 30 秒，然后用凝胶装载机尖端吸气介质。珠子现在变白了。
将重新悬浮的肽直接放在洗涤的珠子上，在四摄氏度下一夜之间用珠子孵育肽。早晨，在4摄氏度下，在2000次g下旋转肽样品，30秒。取出含有未绑定肽的上能物质，如果需要，保存用于将来的实验。
在珠子中加入一毫升冷1X免疫仿纯液，通过倒置五次进行洗涤和混合。在4摄氏度下以2000倍g旋转30秒。吸掉免疫仿纯溶液，再重复免疫仿纯洗涤步骤。
然后将一毫升冷 HPLC 水加入珠子中，并反转五次。在4摄氏度下以2000倍g旋转30秒。吸水，再重复两次水洗步骤。
在4摄氏度下以2000次g旋转一次，30秒，收集管底中剩余的水。与平翻凝胶加载提示，吸走任何额外的水已经收集。小心避免吸珠子。
在水中加入55微升0.15%的三氟乙酸。在室温下孵育珠子10分钟，同时偶尔敲击管子底部进行混合。在室温下在微型离心机中旋转珠子30秒。
使用扁平的倾斜凝胶加载尖端将洗洗的肽转移到新管中。在水中加入45微升0.15%三氟乙酸。在室温下孵育10分钟，偶尔敲击管底混合。
在室温下在微型离心机中旋转珠子30秒。使用扁平的倾斜凝胶加载尖端拆下第二个洗脱，并将其与第一个洗脱相结合。在室温下将组合的洗出肽以12，000次g旋转5分钟，以将任何携带的珠子粒出。
将肽样品溶液转移到新的500微升管中。构建加载方法，将富集的肽混合物加载到 C18 预列芯片上，然后通过移动 A 阶段每分钟两微升洗涤 10 分钟，再次对肽脱盐。构建色谱法，使多肽以每分钟300纳米的流速转移到分析柱，使用移动相 A 和 B 的 2 到 3 小时梯度。
随后，将移动阶段 B 在五分钟内提升至 80%，然后在 80%B 下保持 8 分钟，然后返回 5%B 进行 25 分钟的重新平衡。接下来，构建一种 MS 仪器方法，用于数据相关采集。对于实验一，将MS1前体离子扫描从M/Z 400设置为1500。
将持续时间设置为 120 分钟。创建 IDA 实验，然后单击"确定"。在开关条件选项卡下，设置强度阈值以触发 MS/MS 扫描，以在 2 到 5 到 200 个计数之间触发 MS/MS 扫描。将前体离子的动态排除设置为 60 秒。
对于实验二，将 MS/MS 产品离子扫描设置为 MS2 扫描范围从 M/Z 100 到 1，500。单击编辑参数，将碰撞能量扩散设置为五，并选择高灵敏度产品离子扫描模式。最后，将样品放入自动采样器中。
提交示例队列并开始 LC-MS/MS 采集方法，构建 MS 仪器方法，用于数据独立采集并定义两个仪器扫描实验。执行 MS1 前体离子扫描从 400 到 1，250 质量充电，并设置持续时间为 120 分钟。将碰撞能量扩散设置为 10，累积时间设置为 45 毫秒，然后选择高灵敏度产品离子扫描模式。
接下来，导入包含 64 个变量窗口 DIA SWATH 采集方案的文本文件，以将 SWATH 采集窗口填充到方法中。在此采集方案中，从 5 到 90 质量到充电的可变窗口以增量步骤传递，在 400 到 1，250 质量的完全质量范围内充电，每个段总共有 64 个 SWATH 段，累积时间为 45 毫秒。将 MS1 累积时间调整为 0.25 秒。
MS1 扫描和 64 次 MS2 扫描现在应总共产生 3.2 秒的总周期时间。在这项研究中，实验结果记录了检测和评估PTM相声的可能性。此表显示工作流的时间表以及所需的样品和蛋白质量。
单锅方法可以在一半的时间执行，样本数的一半可以作为这些替代方法执行。在单锅法中，改性肽区域的中值变异系数低于单一PTM和串行PTM富集。在比较单锅PTM和单一PTM浓缩方法时，两种修改的站点级定量相关性没有明显差异。
此图显示成功浓缩的数据，并说明了包含多个和不同交流修饰的肽示例，该修饰图显示 PTM 相声。一种肽在一个裂氨酸残留物上乙酰化，并在另一个裂谷素上被苏奇林化，而在这里，同样的肽在两个裂酸被苏奇林化。这表明，相同的Lysine残留物可以同时使用两个同化组进行修饰，并且有可能在该站点发生相声。
必须确保每个样品都含有相同数量的珠子，并确保在洗涤肽键珠时，没有一个珠子意外吸气。在软件工具（如 Spectronaut）中，基于质谱的分析和数据分析按照此过程执行，以识别、量化和执行 PPTM 的站点定位。这种独立于数据的采集工作流与同时进行 PTM 扩充相结合，将打开途径，更高效地评估 PTM 相声，并提供有关 PTM 信令相关性的更好见解。
