该协议是一种简单的方法来生成泛素和泛素的轮廓，通过识别和半量化特定的识别蛋白质。这项技术的主要优点是使用扁病毒在一周内创建稳定的细胞表达线，并使用两个标签专门纯化蛋白质。事实上，这种翻译后修饰涉及大多数生物功能，而这种机制的改变在大多数疾病中都被发现。
因此，识别这些改变可以作为预测和/或诊断，当然作为分子靶点。泛素是真核细胞中最保守的蛋白质之一，这对它们的生存至关重要。因此，这种方法可以应用于任何真核模型，从哺乳动物到酵母。
然而，我们的扁病毒系统仅限于细胞的研究。由于整个过程相当长，有时潜伏时间很长，所以有可能在两天内完成，而不是一天。从镍珠的埃卢酸盐可以冻结在负20和之前添加旗珠。
该协议包含许多步骤，其中有些是关键，以确保最终成功的纯化，因此准确建立翻译后修改配置文件。实验室的两名博士生米尔娜·斯威登和奥雷利·多布里奇将进行手术演示。首先，在六井板中加入 0.5 倍至 6 个 HEK 293T 细胞，每井 DMEM 有两毫升，种子为 10%FBS，并在 37 摄氏度、5%二氧化碳和 100% 湿度下孵育。
第二天，达到50%到70%的汇合。使用一微克pCCL-6HF泛素样或pCCL-GFP、1微克PBS VG和一微克的增量帮助器载体，使用转染试剂和扁病毒生产方案，对细胞进行混合。转染六小时后，将介质更改为与要转导的细胞介质对应的新鲜介质。
种子细胞被转导在一个六井板与他们的标准培养媒体，以获得10至20%的汇合后一天。转染后24小时，回收含有扁病毒颗粒的介质，并使用0.45微米过滤器进行过滤。更换由含有扁病毒的过滤介质转导的细胞介质。
在37摄氏度和5%的二氧化碳培养箱中用扁病毒孵育细胞24至72小时，然后用新鲜标准培养基体改变培养基。使用倒置荧光显微镜检查 GFP 表达，以评估转导效率。如果未检测到荧光，请再等待两到三天。
如果GP对绿色荧光呈阳性，生长所有细胞，直到有足够的通过免疫荧光执行6-His-FLAG泛素样表达控制，如这里所示，以及使用抗 FLAG 抗体的西方印迹。在15厘米的培养皿中培养细胞后，在室温下至少用磷酸盐缓冲盐水清洗培养皿一次。要开始细胞解，在室温下，将两毫升缓冲液加入每个15厘米的培养皿中。
使用细胞刮刀将所有酸盐回收到 50 毫升锥形离心管中。声波三次，30秒，用一分钟的停顿分开。将声波化的 15，000 次 g 离心 15 分钟。
通过40微米细胞过滤器将上流液转移到新管中。在声波和离心后过滤酸盐是非常重要的。不这样做可能会导致许多非特异性蛋白质的共纯，从而增加背景并强烈减少PTM轮廓的大小。
将 50 到 100 毫克之间的等量蛋白质转移到新的猎鹰管中。将镍离子 NTA 珠子加入每个管中，每一毫克蛋白质含有两微升珠。将管子放在旋转器上，在室温下以 30 rpm 转速旋转 2 个半小时。
然后在500倍g下粒珠5分钟。用一毫升缓冲器清洗珠子，然后将样品转移到1.5毫升微离心管中。将管子放在冰上。
用一毫升的冰冷缓冲液洗两次，其中两粒含有十毫升的 imidazole。为了使用束缚的蛋白质，加入600微升缓冲液，其中含有250毫摩尔伊米达佐尔，并在4摄氏度下旋转两小时。在以500倍g离心对珠子进行造粒后，将上清液转移到新的预冷却1.5毫升管中，并加入50微升的抗 FLAG M2 抗体结合珠。
在 4 摄氏度下以 30 rpm 转速旋转 2 个半小时。然后用500微升的缓冲器洗两次，然后用500微升的缓冲器洗两次。对于最后的洗脱，添加100微升缓冲液三，含有一个 FLAG肽，每微升0.01微克，并在4摄氏度旋转1个半小时。
在500次g下离心一分钟后，将上清液转移到一个新的预冷却管中。将 10 微升加载到 SDS-PAGE 上，对凝胶进行银染色以控制纯化质量。如果纯化效果良好，请分析 LC-MS 留下的 90%。
要执行规范化，请使用配方使药物治疗细胞和未经治疗的细胞之间的值正常化，用于泛素和GP。要去除背景，请从泛素样本中的值中减去对照样本GP中的值，以获得两种条件下每种已识别蛋白质的特定值。为了获得泛泛的变异，获得药物引起的PTM正和负变异的负100和正负变化的分数在负100和正负之间。
处理样品和未经处理样品的特定值之间的差值除以所有值（包括控制值）的总和，并乘以 100。低于负 50 的变异（表示 PTM 的抑制，或高于 50 的变动，表示 PTM 的感应）被视为显著。使用此公式获取介于 50 以上的 0 和 100% 值之间的置信值通常被视为自信值。
若要获得更好的感应和压量值分布，并考虑变化和置信度参数，请使用此公式将方差和置信值相乘。在这项研究中，实现了培养哺乳动物细胞的转导，以产生GP和6-组织旗泛素表达细胞。通过研究GP转导细胞的GGFP荧光，首先控制了扁病毒转导的功效。
FLAG-泛素的表达是使用抗 FLAG抗体进行免疫荧光染色，该抗体显示转导细胞的百分比。为了控制外源 FLAG-泛素的表达水平，SDS-PAGE对转导细胞中的乳解酶进行了分析，然后用抗 FLAG抗体对西印迹进行了分析。纯化泛素蛋白后，10%的最终洗脱用于控制纯化材料的数量和完整性的SDS-PAGE和凝胶的银染色。
背景GP样本减法识别了364种蛋白质明显泛化，得分超过50%，对这些泛素蛋白进行了基因集富集分析，以突出它们所涉及的生物过程。由宝石素引起的泛泛变化形成的潜在相互作用网络。这导致功能相互作用网络的识别强烈受到有关蛋白质的泛化增加或减少的影响。
还证实，在宝石类氨酸处理后，PCNA的泛化增加。避免在两个洗脱步骤后转移一些珠子是非常重要的，因为它可能会导致背景显著增加。此过程将产生特定的翻译后修改，通过比较不同的条件，将使我们能够识别特定的修改。
第一步将至少验证基于生化方法的兴趣变化。我们开发了这种方法来探索基于泛素的翻译后修饰，以确定胰腺癌细胞的新方法和机制。自该议定书和全球开发以来，已经成功地用于破译不同的生物过程。
扁病毒必须至少在BL-2实验室使用。瓜尼丁是一种强变性剂，必须慎用。声波器也可能对耳朵有害，必须按照建议使用。
