Bu protokol bize önemli saflıkta hem quiescent ve yaralanma kaynaklı aktif fibroblast popülasyonları izole sağlar. Bu tekniğin en büyük avantajı doğaçlama esnekliğidir. Akış için, yanı sıra boncuk tabanlı izolasyon, bir izole hedef hücrelerinden onları dışlamak için kirletici hücrelere karşı antikorlar dahil edebilirsiniz.
Bu teknik öncelikle kardiyak fibroblast izolasyonu için kullanılır. Ancak, diğer dokulardan fibroblastlar izole etmek için kullanılabilir. Bu prosedürü gösteren meiling Melzer, bir lisans stajyeri ve David Beier, benim laboratuvar bir araştırma asistanı olacaktır.
Diseksiyon sırasında altı kalbi depolamak için altı kuyuluk bir tabak hazırlamak için, her kuyuya iki mililitre soğuk KHB dağıtın ve plakayı buza yerleştirin. Sprey% 70 etanol ile vücut. Ventral tarafı deneyciye bakacak şekilde yönlendirin.
Paraziti önlemek için uzantıları sabitleyin. Karaciğer piercing olmadan, karın deri ve kas açık kesti. Göğüs kafesini dikey olarak kesin, kalbi delmeden göğüs kafesini dikkatlice aç.
Sonra, kalbi ortaya çıkarmak için göğüs kafesini kesmeye devam edin. Forseps kullanarak, yavaşça göğüs kalbini kaldırın, herhangi bir akciğer veya kalp dışında bağlı aşırı doku keserek. Sol ventrikülden ayırın.
Her diseksiyon için, altı kuyu plaka ayrı bir kuyuda ventrikül yerleştirin. İlk olarak, art arda sıkmak ve fazla kan kaldırmak için KHB ventrikül ajite forseps kullanın. Ventrikül'u temiz, steril, 10 santimetre karelik bir tabağa aktarın.
Daha sonra, tek kenarlı bir bıçak kullanarak, hızlı bir şekilde küçük parçalar halinde ventrikül kıyma. Kollajenaz sindirim kokteyli bir mililitre ekleyin ve kıyma devam edin. Parçalar bir mililitrelik mikropipet ile aktası olacak kadar küçük olduğunda, bunları 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.
Tabağı iki mililitre kokteylle iki kez yıkayın ve yıkamayı tüpe aktarın. Tüpü 30 dakika kuluçkaya yatırın ve el yazmasında açıklandığı gibi hücreleri beş mililitrelik pipet kullanarak yeniden askıya alın. İlk süspansiyondan sonra hücreleri 15 dakika kuluçkaya yatırın ve 10 mililitrelik pipet kullanarak tekrar askıya alın.
Daha sonra, yeni, 50 mililitrelik konik tüpün üzerine 40 mikrometrelik bir hücre süzgeci yerleştirin ve süzgeci bir ila iki mililitre KHB ile ıslatarak süzgeçe asal layın. Sindirim süspansiyon için KHB 25 mililitre ekleyin ve resuspend. Gerektiğinde süzgeç yerine, süzgeç üzerinden süspansiyon filtre.
400 kez g ve 4 santigrat derece 10 dakika filtrasyon santrifüj. Supernatant çıkarın ve kalp başına tampon beş mililitre kullanarak 1x RBC lysis tampon pelet resuspend. Süspansiyonu oda sıcaklığında iki dakika kuluçkaya yattıktan sonra, süspansiyonu 400 kez g'de 10 dakika oda sıcaklığında santrifüj edin.
Supernatant çıkarın ve sonra KHB bir mililitre pelet resuspend. Sonra, süspansiyon için KHB dokuz mililitre ekleyin. Süspansiyonu astarlı, 40 mikrometrelik bir hücre süzgecinden 50 mililitrelik konik bir tüpe süzün.
Konik tüpü 400 kez g'de oda sıcaklığında 10 dakika santrifüj edin. Son olarak, supernatant çıkarın ve fibroblast medya veya PBS bir mililitre pelet resuspend. Hücre numarası belirlendikten sonra, fibroblastlar el yazmasında açıklanan üç farklı yöntemle süspansiyondan izole edilebilir.
Diferansiyel kaplama ile izolasyona başlamak için, her kuyuya iki mililitre fibroblast media ekleyerek altı kuyulu bir plaka hazırlayın. Iyi dipleri kapsayacak şekilde plaka girdap. Fare kalp hücreleri PBS askıya ise, santrifüj ve kalp başına fibroblast media bir mililitre onları resuspend.
Her kuyuya bir mililitre hücre süspansiyonu ekleyin. Hücreleri eşit olarak dağıtmak için plakayı döndürün. Kuyu başına dört mililitreye kadar toplam hacim için iyi başına fibroblast medya ek bir ila iki mililitre ekleyin.
4 saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yat. Fibroblastlar seçici olarak kuyulara yapışacağı için, ortam çıkarılarak ve atılarak izole edilebilirler. Kalan bağlı hücreleri iki mililitre PBS ile yıkayın ve daha sonra her kuyubaşına iki ila dört mililitre steril fibroblast media ekleyin.
37 derecede kuluçkaya yat, her iki ila dört günde bir medya değiştirin. CD45-pozitif hematopoetik hücrelerin manyetik etiketleme ve ayrılmasına başlamak için, fare kalp hücrelerinin 500 kez g beş dakika için bir süspansiyon santrifüj. Supernatant çıkarın ve denge tampon bir mililitre hücre pelet yeniden askıya.
Hemositometre kullanarak hücreleri say. Hücreleri tekrar santrifüj ettikten sonra, denge tampon hücre pelet resuspend. CD45-pozitif manyetik boncuklar ekleyin ve iyice karıştırın.
En az 15 dakika 4 santigrat derecede kuluçkaya yat. Hücreleri denge tamponu ekleyerek yıkayın ve 500 kez g santrifüj dört santigrat derece 10 dakika boyunca. Supernatant çıkarın ve bir hemositometre kullanarak hücreleri saymak.
Denge tamponunda peleti yeniden askıya alın. Hücre kümelerinin ayırma sütununun tıkanmasını önlemek için süspansiyonu 40 mikrometrelik bir filtreden geçirin. Ardından, uygun bir ayırıcının manyetik alanına bir ayırma sütunu yerleştirin ve sütunu en az üç mililitre PBS ile dengeleyin.
Hücre süspansiyonuna sütundan dökün ve etiketlenmemiş hücreleri içeren akışı 15 mililitrelik konik bir tüpe dökün. Sütunu üç mililitre lik denge tamponuyla üç kez yıkayın ve yıkamaları akışla birleştirin. Sütunu ayırıcıdan çıkarın ve sütunu 15 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin.
Etiketli CD45-pozitif hücreleri, pipet beş mililitre denge arabelleği sütuniçine ve sıkıca sütun dalma. Elüent tüpünü ve akış tüpünü 500 kez g.0.00'da santrifüj edin. Hemositometre kullanarak hücreleri say.
İzolasyonun tamamlanması için, CD31-pozitif endotel hücreleri ve CD45-pozitif hücreler için protokole benzer MEFSK4-pozitif fibroblastlar için el yazmasındaki protokolleri uygulayın. Floresan aktive hücre sıralaması miyokard enfarktüsü sonrası alfa-SMA-GFP fare kalplerinden izole edilen tek hücrelerde yapıldı. Temsili bir gating şeması, CD31, CD45 veya AN2'yi birlikte ifade eden GFP pozitif hücreleri gösterir.
Yaralı fare kalplerinde, endotel hücreleri ve hematopoetik hücrelerin küçük bir yüzdesi GFP ifade. Ancak, GFP-pozitif/CD31-negatif/CD45-negatif hücreler perisit belirteci AN2'yi ifade etmediler. GFP-pozitif hücreler alfa-SMA, kollajen bir alfa bir, periostin ve vimentin ifade.
Selektif adezyon ile izole edilen yaralanmamış fibroblastlar vimentin imal etti ancak alfa-SMA, periostin veya kollajen bir alfa bir ekspresyonu göstermedi. Hem yaralanmamış hem de aktif fibroblastlar MEFSK4 antijenini ifade etti. Selektif adezyon la izole edilen yaralanmamış fibroblastlar ve alfa-SMA-GFP farelerinden izole edilen ve sıralanan miyofibroblastlar kollajen leziz olma yeteneğini gösterdi.
Kuluçkadan önce dokuyu iyice kıymak önemlidir. Boncuk bazlı ayırmadan önce, hücre toplamalarını önlemek için süspansiyonun 40 mikrometrelik bir filtreden geçmesi önemlidir. Bu yöntemle saflaştırılan hücreler, yüksek saflık düzeyi sağlamak için perisite özgü antikorlarla ilişkili manyetik boncuklar kullanılarak daha da saflaştırılabilir.
Yeni boncuk konjuge antikorların yanı sıra muhabir transgenik farelerin mevcudiyeti ile, bir izole etmek ve farklı hücresel popülasyonları incelemek için bu teknikleri kullanabilirsiniz, sadece fibroblastlar.
