Questo protocollo ci consente di isolare le popolazioni di fibroblasti attivati sia quiescenti che indotte da lesioni con purezza significativa. Il principale vantaggio di questa tecnica è la sua flessibilità per l'improvvisazione. Per il flusso, così come l'isolamento basato sulle perline, si possono incorporare anticorpi contro le cellule contaminanti per escluderle dalle cellule bersaglio isolate.
Questa tecnica viene utilizzata principalmente per l'isolamento dei fibroblasti cardiaci. Tuttavia, può essere utilizzato per isolare i fibroblasti da altri tessuti. A dimostrare questa procedura saranno Meiling Melzer, uno stagista universitario, e David Beier, un assistente di ricerca del mio laboratorio.
Per preparare una piastra di sei porvili per conservare sei cuori durante la dissezione, erogare due millilitri di KHB freddo in ogni pozzo e posizionare il piatto sul ghiaccio. Spruzzare il corpo con il 70% di etanolo. Orientalo in modo che il lato ventrale sia rivolto verso lo sperimentatore.
Aggiungere le appendici per evitare interferenze. Senza perforare il fegato, aprire la pelle addominale e il muscolo. Tagliare verticalmente verso lo sterno, aprendo con cura il torace senza perforare il cuore.
Successivamente, continua a tagliare la gabbia toracica per esporre il cuore. Usando le forcelle, sollevare delicatamente il cuore dal torace, tagliando via qualsiasi polmone o tessuto in eccesso attaccato all'esterno del cuore. Separare il ventricolo sinistro.
Per ogni dissezione, posizionare il ventricolo in un pozzo separato della piastra a sei pozzi. In primo luogo, utilizzare le forcep per spremere e agitare ripetutamente il ventricolo nel KHB per rimuovere il sangue in eccesso. Trasferire il ventricolo su una piastra pulita, sterile, quadrata di 10 centimetri.
Successivamente, utilizzando una lama a taglio singolo, tritare rapidamente il ventricolo in piccoli pezzi. Aggiungere un millilitro di cocktail di digestione della collagenasi e continuare a tritare. Quando i pezzi sono abbastanza piccoli da essere trasferimento con una micropipetta da un millilitro, trasferirli in un tubo conico da 50 millilitri.
Lavare il piatto due volte con due millilitri di cocktail e trasferire il lavaggio sul tubo. Incubare il tubo per 30 minuti e rimorsi le cellule come descritto nel manoscritto usando una pipetta da cinque millilitri. Dopo la resuspensione iniziale, incubare le cellule per 15 minuti e rimorsi di nuovo usando una pipetta da 10 millilitri.
Quindi, posizionare un colino a celle di 40 micrometri sopra un nuovo tubo conico da 50 millilitri e innescare il colino bagnarlo con uno o due millilitri di KHB. Aggiungere 25 millilitri di KHB alla sospensione della digestione e rimorsi. Filtrare la sospensione attraverso il filtro, sostituendo il filtro in base alle esigenze.
Centrifugare il filtrato a 400 volte g e quattro gradi Celsius per 10 minuti. Rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet in 1 tampone di lisi RBC utilizzando cinque millilitri di tampone per cuore. Dopo aver incubato la sospensione per due minuti a temperatura ambiente, centrifugare la sospensione a 400 volte g per 10 minuti a temperatura ambiente.
Rimuovere il supernatante, quindi rimescolare il pellet in un millilitro di KHB. Quindi, aggiungere nove millilitri di KHB alla sospensione. Filtrare la sospensione attraverso un colino a celle primed da 40 micrometri in un nuovo tubo conico da 50 millilitri.
Centrifugare il tubo conico a 400 volte g per 10 minuti a temperatura ambiente. Infine, rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet in un millilitro di mezzi fibroblasti o PBS. Una volta determinato il numero di cellule, i fibroblasti possono essere isolati dalla sospensione con tre diversi metodi descritti nel manoscritto.
Per iniziare l'isolamento mediante placcatura differenziale, preparare una piastra a sei porsi aggiungendo due millilitri di mezzi fibroblasti ad ogni pozzo. Ruotare il piatto per coprire i fondi del pozzo. Se le cellule cardiache del topo sono sospese in PBS, centrifugarle e rimostrarle in un millilitro di mezzi fibroblasti per cuore.
Aggiungere un millilitro di sospensione cellulare, l'equivalente di un cuore, ad ogni pozzo. Ruotare la piastra per distribuire uniformemente le cellule. Aggiungere uno o due millilitri aggiuntivi di mezzi fibroblasti per pozzo per un volume totale fino a quattro millilitri per pozzo.
Incubare a 37 gradi Celsius per quattro ore. Poiché i fibroblasti aderirono selettivamente ai pozzi, possono essere isolati rimuovendo e scartando il supporto. Lavare le restanti cellule attaccate con due millilitri di PBS, quindi aggiungere da due a quattro millilitri di mezzi fibroblasti sterili per pozzo.
Incubare a 37 gradi fino a confluire, cambiando il supporto ogni due o quattro giorni. Per iniziare l'etichettatura magnetica e la separazione delle cellule ematopoietiche positive al CD45, centrifugare una sospensione delle cellule cardiache del topo a 500 volte g per cinque minuti. Rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet cellulare in un millilitro di tampone di equilibrazione.
Contare le cellule usando un emocitometro. Dopo aver centrifugato di nuovo le cellule, rimorsi il pellet cellulare nel tampone di equilibrazione. Aggiungere perline magnetiche positive per CD45 e mescolare bene.
Incubare per almeno 15 minuti a quattro gradi Celsius. Lavare le cellule aggiungendo tampone di equilibrazione e centrifugando a 500 volte g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere il supernatante e contare le cellule usando un emocitometro.
Resospendare il pellet in tampone di equilibrazione. Passare la sospensione attraverso un filtro da 40 micrometri per evitare che le aggregazioni cellulari intasano la colonna di separazione. Quindi, posizionare una colonna di separazione nel campo magnetico di un separatore adatto ed equilibrare la colonna con almeno tre millilitri di PBS.
Versare la sospensione cellulare attraverso la colonna e raccogliere il flusso-through, che conterrà le celle senza etichetta, in un tubo conico da 15 millilitri. Lavare la colonna tre volte con tre millilitri di tampone di equilibrazione e combinare i lavaggi con il flusso passante. Rimuovere la colonna dal separatore e posizionare la colonna su un tubo conico da 15 millilitri.
Per elutare le celle cd45 positive etichettate, pipettare cinque millilitri di buffer di equilibrazione nella colonna e immergere saldamente la colonna. Centrifugare il tubo di eluente e il tubo di flusso a 500 volte g. Contare le cellule usando un emocitometro.
Per completare l'isolamento, seguire i protocolli nel manoscritto per le cellule endoteliali positive cd31 e i fibroblasti positivi mefsk4, che sono simili al protocollo per le cellule cd45-positive. Lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza è stato eseguito su singole cellule isolate dai cuori del mouse alfa-SMA-GFP a seguito dell'infarto del miocardio. Uno schema di gating rappresentativo dimostra cellule positive alla GFP che co-esprimono CD31, CD45 o AN2.
Nei cuori di topo feriti, una piccola percentuale di cellule endoteliali e cellule ematopoietiche esprimeva GFP. Tuttavia, le cellule GFP-positive/CD31-negative/CD45-negative non esprimevano AN2, un marcatore pericito. Cellule positive alla GFP espresse alfa-SMA, collagene uno alfa, periostina e vimentina.
I fibroblasti illesi isolati per adesione selettiva hanno espresso vimentina ma non hanno dimostrato l'espressione di alfa-SMA, periostina o collagene uno alfa. Sia i fibroblasti illesi che quelli attivati hanno espresso l'antigene MEFSK4. Sia i fibroblasti illesi, isolati per adesione selettiva, sia i miofibroblasti, isolati e ordinati dai topi alfa-SMA-GFP, hanno dimostrato la capacità di contrarre collagene.
È importante tritare accuratamente il tessuto prima dell'incubazione. Prima della separazione basata su perline, è importante passare la sospensione attraverso un filtro da 40 micrometri per evitare aggregazioni cellulari. Le cellule purificate con questo metodo potrebbero essere ulteriormente purificate usando perline magnetiche associate ad anticorpi specifici periciti per garantire un alto livello di purezza.
Con la disponibilità di nuovi anticorpi coniugati con perline, così come topi transgenici reporter, si possono utilizzare queste tecniche per isolare e studiare popolazioni cellulari distinte, non solo fibroblasti.
