פרוטוקול זה מאפשר לנו לבודד הן אוכלוסיות פיברובלסט המופעלות על ידי הרה-קיפאון והן אוכלוסיות פיברובלסט המופעלות על ידי פציעות עם טוהר משמעותי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הגמישות שלה לאלתור. לזרימה, כמו גם בידוד מבוסס חרוזים, ניתן לשלב נוגדנים נגד תאים מזהמים כדי להוציא אותם מתאים היעד המבודדים.
טכניקה זו משמשת בעיקר לבידוד פיברובלסט לבבי. עם זאת, זה יכול להיות מנוצל כדי לבודד fibroblasts מרקמות אחרות. הפגנה של הליך זה תהיה מילינג מלצר, מתמחה לתואר ראשון, ודיוויד באייר, עוזר מחקר מהמעבדה שלי.
כדי להכין צלחת שש בארות לאחסון שישה לבבות במהלך הניתוח, מחלקים שני מיליליטר של KHB קר לתוך כל באר, ומ מניחים את הצלחת על קרח. לרסס את הגוף עם 70% אתנול. כוון אותו כך שהצד הגחון יעמוד מול הניסוי.
הצמד את התוספות כדי למנוע הפרעות. מבלי ל פירסינג הכבד, לחתוך לפתוח את עור הבטן ואת השריר. חותכים אנכית לכיוון עצם החזה, בזהירות לפתוח את בית החזה מבלי ל פירסינג הלב.
לאחר מכן, להמשיך לחתוך דרך בית החזה כדי לחשוף את הלב. באמצעות מדפים, בעדינות להרים את הלב מהחזה, חיתוך כל ריאה או רקמה עודפת מחובר בצד החיצוני של הלב. הפרד את החדר השמאלי.
עבור כל ניתוח, מניחים את החדר באר נפרדת של צלחת שש בארות. ראשית, להשתמש במקלפים כדי לסחוט שוב ושוב להתסיס את החדר ב KHB כדי להסיר דם עודף. מעבירים את החדר לצלחת נקייה, סטרילית, 10 ס"מ מרובע.
לאחר מכן, באמצעות להב חד קצוות, במהירות טחון החדר לחתיכות קטנות. מוסיפים מיליליטר אחד של קוקטייל עיכול קולגן, וממשיכים לכרסם. כאשר החלקים קטנים מספיק כדי לעבור עם מיקרופיקט מיליליטר אחד, להעביר אותם צינור חרוט 50 מיליליטר.
לשטוף את הצלחת פעמיים עם שני מיליליטר של קוקטייל, ולהעביר את לשטוף לצינור. דגירה הצינור במשך 30 דקות, ושימוש חוזר בתאים כמתואר בכתב היד באמצעות פיפט חמישה מיליליטר. לאחר ההמשך הראשוני, דגירה התאים במשך 15 דקות, ולהשתמש שוב באמצעות פיפטה 10 מיליליטר.
לאחר מכן, מניחים מסננת תאים 40 מיקרומטר על גבי צינור חרוט חדש, 50 מיליליטר, וראש מסננת על ידי הרטבת אותו עם אחד עד שני מיליליטר של KHB. הוסיפו 25 מיליליטר של KHB להשעיית העיכול, והוסיפו שימוש חוזר. לסנן את ההשעיה דרך מסננת, החלפת מסננת לפי הצורך.
צנטריפוגה לסינון ב 400 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. הסר את על-טבעי, ולהשתמש מחדש את גלולה 1x RBC מאגר lysis באמצעות חמישה מיליליטר של חיץ לכל לב. לאחר הדגירה המתלה במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר, צנטריפוגה ההשעיה ב 400 פעמים g במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
הסר את supernatant, ולאחר מכן תן שוב את גלולה במיליליטר אחד של KHB. לאחר מכן, להוסיף תשעה מיליליטר של KHB להשעיה. סנן את ההשעיה דרך מסננת תאי 40 מיקרומטר לצינור חרוטי חדש של 50 מיליליטר.
צנטריפוגה הצינור חרוט ב 400 פעמים g במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לבסוף, להסיר את supernatant, ולתלות מחדש את גלולה במיליליטר אחד של מדיה fibroblast או PBS. לאחר שנקבע מספר התא, ניתן לבודד פיברובלסטים מההשעיה בשלוש שיטות שונות המתוארות בכתב היד.
כדי להתחיל בבידוד על ידי ציפוי דיפרנציאלי, הכינו צלחת של שש בארות על ידי הוספת שני מיליליטר של מדיה פיברובלסט לכל באר. מערבל את הצלחת כדי לכסות את תחתיות באר. אם תאי הלב של העכבר מושעים ב- PBS, צנטריפוגה ו- resuspend אותם במיליליטר אחד של מדיה fibroblast לכל לב.
הוסף מיליליטר אחד של השעיית תא, המקבילה של לב אחד, לכל באר. מערבלים את הצלחת כדי להפיץ תאים באופן שווה. הוסף אחד עד שני מיליליטר נוספים של מדיה fibroblast לבא עבור נפח כולל של עד ארבעה מיליליטר לבא.
דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך ארבע שעות. מכיוון שהפיברובלסטים ידבקו באופן סלקטיבי בארות, הם יכולים להיות מבודדים על ידי הסרה והשמטה של התקשורת. לשטוף את התאים המצורפים הנותרים עם שני מיליליטר של PBS, ולאחר מכן להוסיף שניים עד ארבעה מיליליטר של מדיה פיברובלסט סטרילי לכל באר.
דגירה ב 37 מעלות עד confluent, שינוי התקשורת כל יומיים עד ארבעה ימים. כדי להתחיל את התיוג המגנטי וההפרדה של תאים hematopoietic חיובי CD45, צנטריפוגה השעיה של תאי לב העכבר ב 500 פעמים g במשך חמש דקות. הסר את העל-טבעי, ולחץ מחדש על גלולת התא במיליליטר אחד של מאגר שיווי משקל.
לספור את התאים באמצעות מד חמוציט. לאחר צנטריפוגה של התאים שוב, תן שימוש חוזר לכדור התא במאגר שיווי משקל. הוסיפו חרוזים מגנטיים חיוביים ל-CD45, וערבבו היטב.
דגירה לפחות 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לשטוף את התאים על ידי הוספת חיץ שיווי משקל צנטריפוגה ב 500 פעמים גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. הסר את העל-טבעי וספיר את התאים באמצעות מד חמוציטים.
תן את גלולת החיץ במאגר שיווי משקל. העבר את ההשעיה דרך מסנן של 40 מיקרומטר כדי למנוע מצבור תאים לסתימת עמודת ההפרדה. לאחר מכן, מקם עמודת הפרדה בשדה המגנטי של מפריד מתאים, וצייד את העמודה בשלושה מיליליטר לפחות של PBS.
יוצקים את ההשעיה התא דרך העמוד, ולאסוף את זרימה דרך, אשר יכיל את התאים unlabeled, בצינור חרוט 15 מיליליטר. לשטוף את העמוד שלוש פעמים עם שלושה מיליליטר של חיץ שיווי משקל, ולשלב את לשטוף עם זרימה דרך. הסר את העמודה מהמפריד והצב את העמודה על צינור חרוט של 15 מיליליטר.
כדי להפוך את התאים החיוביים ל- CD45 המסומנים בתווית CD45, צנרת חמישה מיליליטר של מאגר שיווי משקל לתוך העמודה וצניחת העמודה בחוזקה. צנטריפוגה הצינור של eluent ואת הצינור של זרימה דרך ב 500 פעמים g. לספור את התאים באמצעות מד חמוציט.
כדי להשלים את הבידוד, בצע את הפרוטוקולים בכתב היד עבור תאי ה אנדותל חיוביים CD31 ו FIbroblasts חיובי MEFSK4, הדומים לפרוטוקול עבור תאים חיוביים CD45. מיון תאים המופעל על-ידי פלואורסצנטיות בוצע בתאים בודדים המבודדים מלבבות עכבר אלפא-SMA-GFP בעקבות אוטם שריר הלב. ערכת גתים מייצגת מדגימה תאים חיוביים ל- GFP המבטאים במשותף CD31, CD45 או AN2.
בלבבות העכבר הפצועים, אחוז קטן של תאי אנדותל ותאים hematopoietic לידי ביטוי GFP. עם זאת, תאים שליליים/שליליים/CD45-GFP לא בטאו AN2, סמן פריציטי. תאים חיוביים GFP ביטא אלפא-SMA, קולגן אחד אלפא אחד, פריוסטין, ו vimentin.
פיברובלסטים לא פצועים מבודדים על ידי הידבקות סלקטיבית הביעו וימנטין אך לא הפגינו ביטוי של אלפא-SMA, פריוסטין או קולגן אחד אלפא אחד. הן פיברובלסטים לא פצועים והן פיברובלסטים מופעלים הביעו את האנטיגן MEFSK4. שני פיברובלסטים לא מוצדקים, מבודדים על ידי הידבקות סלקטיבית, ומיופיברובלסטים, מבודדים וממוינים מעכברי אלפא-SMA-GFP, הפגינו יכולת להידבק בקולגן.
חשוב לטחון את הרקמה ביסודיות לפני הדגירה. לפני הפרדה מבוססת חרוזים, חשוב להעביר את ההשעיה דרך מסנן 40 מיקרומטר כדי למנוע צבירות תאים. התאים המטוהרים בשיטה זו יכולים להיות מטוהרים עוד יותר באמצעות חרוזים מגנטיים הקשורים לנוגדנים ספציפיים לפוריסט כדי להבטיח רמה גבוהה של טוהר.
עם הזמינות של נוגדנים חדשים חרוזים תרכובת, כמו גם עכברים מהומשים כתב, אפשר להשתמש בטכניקות אלה כדי לבודד וללמוד אוכלוסיות תאיות נפרדות, לא רק fibroblasts.
