超声波增强原成人成纤维细胞隔离

我们的协议为原发性成纤维细胞分离提供了简单快捷的方法，明确侧重于避免细菌污染，这是一个大问题。特别是对于初学者。我们技术的主要优点是它的简单性。

因为它不需要广泛的手工技能或经验，而且每个人都可以在短时间内轻松学习。展示这项技术的将是曼贾·纽，一个来自实验室的技术员。在开始解剖之前，戴上两副一次性手套，另一副放在另一副手套上。

将鼠标固定到聚苯乙烯垫上。用70%乙醇对毛皮进行消毒，确保动物被浸泡。并使用乙醇消毒手术钳和创伤剪刀杯上尿道上方的皮肤。

从最初的切口到颈部，沿着中线切三到四厘米，增加四肢的浮雕切口。将皮肤固定在垫上，以获得最佳地接触覆盖腹腔的肌肉。然后，用新鲜70%乙醇对腹部肌肉进行两次消毒。

乙醇干燥后，取下第一副手套。并使用一套新的无菌钳子和剪刀来插入肌肉层，以打开腹腔和胸部。要切除感兴趣的器官，请用手术钳轻轻抓住每个器官，而不刺穿组织。

用剪刀小心地切断器官入口点附近的供血血管。将每个器官放入无菌、冰冷的 PBS 管中，并紧闭管。将每个管子放在湿冰上，因为器官被收集。

当所有器官都收获后，先用70%乙醇喷洒管子，然后再将它们放入无菌细胞培养罩中。戴上一副新鲜的手套，使用无菌钳子将每个器官转移到无菌六厘米培养皿的一半上。用新鲜的PBS短暂清洗器官，以去除多余的血液。

将冲洗过的器官转移到每个培养皿的后半部分，并去除多余的PBS。使用两个无菌手术刀，将器官切成一到两毫米的碎片。并使用无菌铲子将组织片段转移到新的、单独的、无菌的 15 毫升管中。

在每个管中加入两毫升0.25%的三辛肌溶液。将管子放入37摄氏度的细胞培养箱中5分钟。在孵育结束时，每分钟旋转约1400次，旋转管子10秒。

并阻止三普辛反应与四毫升的适当培养，辅以胎儿小牛血清每管。接下来，将适当体积的胶原酶混合溶液添加到每个管中。将管子放在37摄氏度的超声波水浴中10分钟。

在声波的末尾，轻轻旋转管子10秒钟。将管子放回超声波水浴 10 分钟之前。在第二次声声结束时，将管子旋转10秒。

用70%乙醇对管子进行消毒。在细胞培养罩中，通过单个40微米滤株将细胞悬浮液过滤成新的无菌15毫升管。通过离心收集细胞。

将颗粒重新悬浮在每管一毫升新鲜介质中。并在适当的电镀密度下查看合适的细胞培养容器中的细胞。然后，将细胞放在细胞培养箱中过夜。

第二天早上，用PBS清洗每个培养物三次，然后加入新鲜培养剂，将细胞返回培养箱。使用本协议，可获取可行的成纤维细胞，用于后续实验。如氨基荧光染色或增殖实验。

成人成纤维细胞是扁平的主轴状细胞，具有多种细胞过程，通常以单层生长。然而，可以观察到不同器官的成纤维细胞种群的形态差异。例如，肾成纤维细胞比心脏、肺或肝成纤维细胞更小，密度更高。

孤立的成纤维细胞具有很高的增殖率，在大约六天后达到超过90%的光汇合。在这里，可以观察到具有独特阿尔法平滑肌肉行为素微丝的分化肌纤维细胞。这些细胞在心脏、肾脏、肝脏和肺细胞培养中大量发现。

虽然只有约20%至30%的分离和培养细胞表达有序，有安排的，阿尔法平滑肌肉行为素微丝，几乎所有的细胞是积极的维门丁和迪斯科丁域受体2后，七天培养。要记住的最重要的事情是在整个过程中使用正确的技术，因为必须避免细菌污染。原发性成纤维细胞分离后，细胞可用于各种精神病学实验和表征。

如免疫细胞化学增殖或伤口愈合论文，或分子生物学评估。