Этот протокол позволяет нам изолировать как тихие, так и вызванные травмами активированные популяции фибробластов со значительной чистотой. Основным преимуществом этой техники является ее гибкость для импровизации. Для потока, а также на основе бисера изоляции, можно включить антитела против загрязняющих клеток, чтобы исключить их из изолированных клеток-мишеней.
Этот метод в первую очередь используется для сердечной фибробластовой изоляции. Тем не менее, он может быть использован для изоляции фибробластов от других тканей. Демонстрацией этой процедуры будут Мейлинг Мельцер, стажер бакалавриата, и Дэвид Beier, научный сотрудник из моей лаборатории.
Чтобы подготовить шесть хорошо пластины для хранения шести сердец во время вскрытия, обойтись два миллилитров холодного KHB в каждый колодец, и место пластины на льду. Спрей тела с 70%этанола. Ориентируйте его так, чтобы вентраальная сторона столкнулась с экспериментатором.
Прикрепите придатки, чтобы предотвратить помехи. Не прокалывая печень, разрежьте брюшную кожу и мышцы. Вырезать вертикально к грудине, тщательно открывая грудную клетку, не прокалывая сердце.
Далее, продолжать прорезать грудную клетку, чтобы разоблачить сердце. Используя типсы, аккуратно поднимите сердце из груди, отрезав любое легкое или избыток ткани, прикрепленной к внешней стороне сердца. Разделив левый желудочек.
Для каждого вскрытия поместите желудочек в отдельный колодец из шести хорошо пластины. Во-первых, используйте типсы, чтобы неоднократно сжимать и агитировать желудочек в KHB, чтобы удалить избыток крови. Перенесите желудочек на чистую, стерильную, 10-сантиметровую тарелку.
Затем, используя одноконечное лезвие, быстро измельчите желудочек на мелкие кусочки. Добавьте один миллилитр коктейля для пищеварения коллагеназы и продолжайте заминку. Когда кусочки достаточно малы, чтобы передать с помощью микропипера с одним миллилитровым, перенесите их в 50-миллилитровую коническую трубку.
Вымойте тарелку дважды с двумя миллилитров коктейля, и передать мыть в трубку. Инкубировать трубку в течение 30 минут, и повторно использовать клетки, как описано в рукописи с помощью пятими миллилитров пипетки. После первоначального повторного успения, инкубировать клетки в течение 15 минут, и повторно использовать 10-миллилитровый пипетку.
Затем поместите 40-микрометровый клеточный ситечко поверх новой, 50-миллилитровой конической трубки, и премьер ситечко, смачивая его с одним-двумя миллилитров KHB. Добавьте 25 миллилитров KHB в подвеску пищеварения и повторное добавление. Фильтр подвески через ситечко, заменив ситечко по мере необходимости.
Центрифуга фильтрата при 400 раз g и 4 градуса по Цельсию в течение 10 минут. Удалить супернатант, и повторно гранулы в 1x РБК лиза буфера с помощью пяти миллилитров буфера на сердце. После инкубации подвески в течение двух минут при комнатной температуре, центрифуга подвески в 400 раз g в течение 10 минут при комнатной температуре.
Удалить супернатант, а затем повторно гранулы в один миллилитр KHB. Затем добавьте девять миллилитров KHB к подвеске. Фильтр подвески через загрунтованные, 40-микрометровый ситечко клеток в новую, 50-миллилитровую коническую трубку.
Центрифуга конической трубки при 400 раз г в течение 10 минут при комнатной температуре. Наконец, удалить супернатант, и повторно гранулы в один миллилитр фибробластового мультимедиа или PBS. После того, как номер ячейки был определен, фибробласты могут быть изолированы от подвески тремя различными методами, описанными в рукописи.
Чтобы начать изоляцию дифференциальным покрытием, подготовьте пластину из шести хорошо, добавив два миллилитров фибробластового средства массовой информации к каждой хорошо. Закружить пластину, чтобы покрыть днища. Если клетки сердца мыши приостановлены в PBS, центрифуга и повторно использовать их в один миллилитр фибробластов средств на сердце.
Добавьте к каждому хорошо один миллилитр клеточной суспензии, эквивалентный одному сердцу. Закружить пластину, чтобы равномерно распределить клетки. Добавьте еще от одного до двух миллилитров фибробластов на колодец для общего объема до четырех миллилитров на колодец.
Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение четырех часов. Поскольку фибробласты будут избирательно придерживаться скважин, они могут быть изолированы путем удаления и отбрасывания средств массовой информации. Вымойте оставшиеся прикрепленные клетки с двумя миллилитров PBS, а затем добавить два-четыре миллилитров стерильных фибробластов средств массовой информации на колодец.
Инкубировать при 37 градусах до слияния, меняя средства массовой информации каждые два-четыре дня. Для начала магнитной маркировки и разделения CD45-положительных гематопоэтических клеток, центрифуга подвески клеток сердца мыши в 500 раз г в течение пяти минут. Удалите супернатант и повторно посовестийте клеточные гранулы в один миллилитр эквилибрации буфера.
Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. После центрифугирования клеток снова, повторное приостановление ячейки гранулы в буфере эквилибрации. Добавить CD45-положительные магнитные бусы, и хорошо перемешать.
Инкубировать в течение по крайней мере 15 минут при четырех градусах по Цельсию. Вымойте клетки, добавив эквилибрации буфера и центрифугирования в 500 раз г в течение 10 минут при четырех градусах по Цельсию. Удалите супернатант и посчитайте клетки с помощью гемоцитометра.
Повторное приостановление гранул в буфере эквилибрации. Перейдите подвеску через 40-микрометровый фильтр, чтобы предотвратить засорение столбца разделения. Далее поместите разделительный столбец в магнитное поле подходящего сепаратора и уравновестите столбец как минимум тремя миллилитровами PBS.
Налейте подвеску клетки через колонку, и собирать поток через, который будет содержать неоцеличные клетки, в 15-миллилитровой конической трубки. Вымойте столбец три раза с тремя миллилитров эквилибрации буфера, и объединить моет с протекаемой. Снимите столбец с сепаратора и поместите столбец на 15-миллилитровую коническую трубку.
Чтобы утоить помеченные CD45-положительные ячейки, пипетки пять миллилитров эквилибрации буфера в колонку, и окунуться колонку твердо. Центрифуга трубки элуента и трубки протекать в 500 раз г. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.
Чтобы завершить изоляцию, следуйте протоколам в рукописи для CD31-положительных эндотелиальных клеток и MEFSK4-положительных фибробластов, которые аналогичны протоколу для CD45-положительных ячеек. Флуоресценционная сортировка клеток проводилась на одиночных клетках, изолированных от альфа-SMA-GFP мышей после инфаркта миокарда. Репрезентативная схема закрытого управления демонстрирует GFP-позитивные ячейки, совместно выражаюющие CD31, CD45 или AN2.
В сердцах раненых мышей небольшой процент эндотелиальных клеток и гематопоэтических клеток выражается GFP. Тем не менее, GFP-положительные/CD31-отрицательные/CD45-отрицательные клетки не выражали AN2, перицитный маркер. GFP-положительные клетки выразили альфа-SMA, коллаген один альфа один, периостин, и виментин.
Невредимые фибробласты, изолированные селективной адгезией, выраженной виментином, но не продемонстрировали экспрессию альфа-СМА, периостина или коллагена одной альфа-одной. Оба невредимых и активированных фибробластов выразил MEFSK4 антиген. Оба невредимых фибробластов, изолированных селективной адгезией, и миофибробласты, изолированные и отсортированные от мышей альфа-SMA-GFP, продемонстрировали способность к заражению коллагеном.
Важно тщательно измельчить ткань перед инкубацией. Перед разделением на основе бисера важно пройти подвеску через 40-микрометровый фильтр, чтобы предотвратить агрегации клеток. Клетки, очищенные этим методом, могут быть дополнительно очищены с помощью магнитных бусин, связанных с перицит-специфическими антителами, чтобы обеспечить высокий уровень чистоты.
При наличии новых бисероразгряженных антител, а также репортер трансгенных мышей, можно использовать эти методы для изоляции и изучения различных клеточных популяций, а не только фибробластов.
