使用此协议去除样本间变异可以深入了解基于 mRNA 和蛋白质水平之间的样本内差异的大分子的差分调控。使用相同的样本来分离DNA、RNA和蛋白质是减少变异性、提高可重复性以及促进解释的尝试。好处包括样品采集时节省的时间和资源，以及对有价值的有限样品进行横截面分析。
首先，在一个10厘米的板中播种1000个蠕虫卵，并具有适当的生长条件。在20摄氏度下孵育72小时。然后，用5毫升的M9缓冲液清洗盘子，将1000只成年蠕虫转移到一个管子中。
将蠕虫以1000克离心1分钟，丢弃上流液，用1毫升M9缓冲液将颗粒蠕虫转移到1.5毫升微离心管中。再次以 845 g 离心一分钟，并丢弃大部分上一代。将颗粒蠕虫存放在零下80摄氏度以上4小时以上。
接下来，从解冻的颗粒中去除任何上一代。加入一毫升冷GTCP试剂，上下移液，将样品放在冰上10分钟。然后，加入200微升的冷氯仿。
用力摇动管子15秒钟，在室温下保持3分钟。接下来，在4摄氏度下将管在13，500克离心15分钟。使用微移液器，将透明顶层转移到新的无 RNase 1.5 毫升微离心管中。
将多云的白色相间层转移到标有 B2 的新管中，然后将粉红色层从剩余的颗粒转移到标有 B 的新管中，并放在冰上。明确分离这三层可能很困难。我建议将多云的相间层转移到它自己的管子中，而不是从有机层或粉红色层中沉淀出该层的DNA。
要分离RNA，首先在管 A 中加入 500 微升 100%异丙醇，以沉淀 RNA。然后，在室温下孵育管子10分钟。孵育后，在4摄氏度下将管在13，500克离心10分钟。
接下来，丢弃上总和，在管 A 中加入一毫升 75% 乙醇以清洗颗粒。在4摄氏度下将管子在5，300克下离心5分钟。丢弃上一液，让颗粒空气干燥 5 至 10 分钟。
加入50微升无RNase水，重组RNA颗粒，并在55至60摄氏度下孵育颗粒10分钟溶解。最后，使用分光光度计测量260纳米分离RNA的浓度，并在230纳米和280纳米时识别任何杂质。为了分离DNA，首先在B管的有机相和B2的多云白层中加入300微升100%乙醇，以沉淀DNA，通过反转混合，在室温下离开管2至3分钟。
然后，离心管B和B2在376克在4摄氏度下5分钟粒粒DNA。将B管和B2的上清液混合到标有C的两毫升新管子中，放在冰上，以便随后进行蛋白质分离。接下来，用10%乙醇中1毫升0.1摩尔柠檬酸钠清洗B2中的DNA颗粒30分钟。
在摄氏四度下以376克的离心管B2，5分钟。重复洗涤步骤，然后将颗粒重新悬浮在 75% 乙醇的 1.5 毫升中，并在室温下保持 20 分钟。接下来，在4摄氏度下在376克的离心管B2下5分钟，然后丢弃上干液，让颗粒干燥5至10分钟。
将颗粒溶解在 150 微升的 8 毫升氢氧化钠中。然后，在4摄氏度下将样品在376克下离心5分钟。最后，用微管将含有DNA的上一液转移到一个新的管子上。
使用分光光度计测量 260 纳米的分离 DNA 浓度，并在 230 纳米和 280 纳米时识别任何杂质。为了沉淀蛋白质，首先将1.5毫升100%异丙醇加入管C中的粉红色上清液中，通过反转数次混合，并在室温下孵育10分钟。然后，离心管C在13，500克在4摄氏度10分钟。
丢弃上一液，在室温下用两毫升0.3摩尔甘酸碱洗净20分钟。在4摄氏度下将管子再次在5，300克下离心5分钟，并重复洗涤步骤。将蛋白质颗粒转移到标有C2的新的1.5毫升管中，并加入1.5毫升的95%乙醇、涡流，让它在室温下坐20分钟。
在4摄氏度下将管子在5，300克下离心5分钟。丢弃上一液，让颗粒在室温下干燥10分钟。然后，在50摄氏度下将颗粒溶解在300微升5%SDS中，60分钟。
最后，在17摄氏度下将管在13，500克离心10分钟。将含有蛋白质的上清液转移到新管中。执行定量逆转录PCR。
首先，使用分离RNA的一个纳米图，通过逆转录来准备cDNA。要制作cDNA的库存板，将每个cDNA样品的100微升1至100个稀释剂添加到96孔板的单个孔中，包括适当的控制，如仅水井和连续稀释样品，以建立每个基因的底法效率。要对每组底转进行主混合，请添加多达七微升的水、DNA-分质氰化物染料和五个微摩尔，每个方向和反向底剂各一个。
将主混合物的七微升添加到RT-qPCR板的适当孔中。然后，从库存板中加入三个 cDNA 微升，并使用适用于使用的底向器的 RT-qPCR 协议运行板。对三种蠕虫菌株的四个独立样本的分离mRNA进行了RT-qPCR分析，以确认RNA seq测定所确定的目标。
F07C4.12基因在吃-2蠕虫的两种检测中均得到调控，但RT-qPCR检测未检测到其在rsks-1蠕虫中的上调节。此外，RNA seq通过RT-qPCR检测出在吃-2和rsks-1蠕虫中mmp-1的表达变化。
在由SDS页面分离并沾染了库马西蓝的蠕虫中，GTCp与RIP提取的蛋白质的比较显示，GTCp提取的蛋白质具有更好的分辨率。西方的印迹分析显示，在大多数情况下，蛋白质水平相似;然而，大于75千达顿的蛋白质在RIPA提取的蛋白质中含量较低。从三种蠕虫菌株的四个单独样本中的目标mRNA和蛋白质水平进行比较，表明mRNA水平的变异性较低，蛋白质水平的变异性更大。
在DNA分离的上下文中，产量高度依赖于从有机层或粉红色层恢复多云相间层的熟练程度。为了改善颗粒中蛋白质的溶解，可能需要增加除溶解缓冲液的体积或添加除SDS以外的其他洗涤剂。使用这种方法有助于正确识别mRNA对蛋白质的转化不是核心性的情况，并可能导致对各种条件下的转录后和翻译后调控机制进行更深入的研究。
在我们的实验室中，该协议已用于保存宝贵和有限时间的核心样品。此外，我可以想象这将是一个有用的协议，采用在昼夜节律场。RNA分离中使用的GCTP试剂和溶剂存在危害，应谨慎使用。
