单核细胞分离研究人类粘膜淋巴组织中先天免疫反应

通西拉单核细胞比血细胞更相关、更复杂，它们的分离使得研究涉及粘膜免疫的病理中的免疫细胞反应。我们建立的技术允许从粘膜组织中恢复大量的免疫细胞，同时保持其完整性进行外活研究。这种方法非常简单，但扁桃体需要迅速和小心处理，以最大限度地提高产量。

如手稿文本所述，将人类扁桃体组织运送到实验室。接下来，将细胞过滤器放在150由25毫米培养皿上。将所有解剖仪器放在另一盘中，以保持无菌。

应谨慎处理您的所有主要标本，因为它们以前没有资格，可能含有传染性病原体。然后将 PBS 从小瓶倒入过滤器中，因为它将包含一些出口扁桃体的细胞。使用无菌钳子，使用无菌钳子将扁桃体从小瓶转移到培养皿中。

如有必要，添加更多 PBS 以浸入网格。解剖需要大约45分钟每扁桃体。在此期间，扁桃体必须被淹没，以确保良好的生存能力和细胞产量。

使用钳子和手术刀去除烧灼的血和肌瘤组织。使用手术刀和弯曲的钳子，将组织切成直径小于半厘米的小碎片。切割所有组织，使小块可以在任何时候浸泡。

将几块组织放在细胞过滤器中。用玻璃刺把它们刮到网格上，直到只剩下一层非常薄的白色频闪。拆下并丢弃频闪，以避免堵塞网格。

然后使用 10 毫升移液器将电池悬浮液转移到栅格上，最后刮擦它。接下来，使用10毫升移液器将细胞悬浮液转移到无菌小瓶中。用 PBS 清洗网格和细胞过滤器一次，然后将 PBS 也转移到小瓶。

在继续之前，让电池悬浮液在室温下在长凳上休息五分钟。将无菌的 70 微米筛放在新的 50 毫升小瓶上。用 10 毫升移液器轻轻将电池悬浮液转移到筛子上。

如果筛子堵塞，使用无菌的一毫升移液器尖端的背面刮过筛子的细胞。必要时经常更换筛子。在4摄氏度下以250倍g离心细胞，10分钟。

离心后，丢弃上经剂。轻轻敲击小瓶，然后用35毫升PBS重新悬浮细胞，重新悬浮颗粒。要完成细胞分离的第一阶段，将新的70微米筛放在新小瓶的顶部，然后用10毫升移液器将细胞悬浮液转移到它上面。

为了获得更清晰的细胞溶液，首先将15毫升的密度梯度介质添加到新的50毫升小瓶中。将 TMC 溶液倒在密度梯度介质上，小心尽量减少混合。接下来，在室温下以 1000 倍 g 离心溶液，在加速和制动关闭时将溶液离心 30 分钟。

从离心机取出小瓶后，使用 10 毫升移液器拆下并丢弃上层。请勿干扰 TMC 和密度梯度介质之间的接口。然后用无菌的一毫升移液器尖端取出 TMC，并将其转移到新的 50 毫升小瓶中。

要清洗细胞，首先加入50毫升PBS，含有2%的胎儿牛血清和2毫升EDTA。然后在4摄氏度下以250倍g离心管，10分钟。再次清洗细胞，但这次在400倍g下将管子离心，在4摄氏度下10分钟。

通过补充RPMI 1640与10%的热灭活FBS、2毫摩尔L-谷氨酰胺和抗生素溶液，准备R10培养基。在 R10 的 10 毫升中重新挂起 TMC。然后计算单元格。

细胞可以立即使用或冷冻供将来使用，如手稿中所述。TMC被染色，用抗体孵育，并描述使用流细胞学。TMC包含血液中的周围单核细胞中存在的所有主要免疫细胞类型，简称PMBC。

然而，除B细胞外，所有细胞类型的频率在TMC中的频率都低于PBMC。为了研究细胞因子生产中的细胞活化，TMC在一夜之间被安魂曲R848刺激。TMC 以蓝色绘制，生产了除 IFN Lambda 2/3 和 IL-8 之外的所有细胞因子，尽管产量低于 PBMC，以绿色绘制。

将 R848 刺激与无刺激进行比较的折叠增加以红色表示。纯化和隔离的TMC、蓝色和扁桃体组织集团，橙色，被刺激24小时与甲型流感病毒，IAV。IFN生产在TMC中检测到，但在组织组的上半时性检测表明组织外植不是研究细胞因子分泌和细胞活化的最佳模型。

在与有毒药物C1进行预孵化和用R848刺激后，对TMC和PBMC进行可行性检测。TMC 对 C1 更敏感。这表明，未来治疗中的新药应该在组织细胞中进行测试，而不只是在细胞系、PBMC或组织外植上。此过程允许我们使用像全血的 PBMC 一样的 TMC，并执行相同的细胞实验，如特定细胞类型的纯化、细胞培养、流式细胞学或冷冻。

TMC的分离使得在相关模型中更好地描述涉及粘膜免疫的病理学中继发淋巴器官的免疫反应成为可能。