该协议提供了一种方法，从任何心脏组织隔离杆状心肌细胞，然后可用于测量这些心肌细胞的倍数和核化状态，而无需人工分析。与其他技术相比，我们的协议提供了更一致的细胞产量和细胞形态，与流动细胞学相比，我们能够直观地验证心肌细胞的成核和倍体状态。这种方法的视觉演示很重要，因为心脏组织分裂和关联更容易被理解。
首先将安乐死小鼠置于一个超前位置，然后向下录制扩展的四肢。用钝头剪刀切开胸部，露出心。然后削减下降大动脉和推断维纳卡瓦。
使用附着在输液组上的腹皮泵，用 23 量蝴蝶针通过左心室注射三毫升氯化钾 PBS 溶液来使心脏具有功能。确保不要刺穿隔膜。然后以每分钟一毫升的速度注射 10 毫升 4%PFA 溶液 10 分钟。
用剪刀把整个心脏都去掉。如果需要，请隔离特定区域。将组织放在含有1毫升4%PFA溶液的1.5毫升离心管中。
在摇杆上孵育一小时。使用 PBS 溶液将心脏放在培养皿中。挤压它，以摆脱任何PFA留在心室，并在PBS洗。
将固定的心脏放入含有拼贴蛋白溶液的新的1.5毫升管中。然后在37摄氏度的摇杆上孵育心脏过夜。第二天，把心脏放在一个35毫米的培养皿里，里面装着拼贴液溶液，用钳子或剪刀把它分成一毫米。
然后使用转移移液器进一步三化分离的组织两分钟。如果组织颗粒仍然存在，请使用具有较窄尖端的移液器，并继续三角化，直到大部分组织被分解。将 200 至 600 微米尼龙网放在 15 毫米离心管上。
将五毫升 PBS 添加到分离的细胞中，并通过尼龙网过滤它们。通过额外四毫升 PBS 清洗尼龙网。然后在 10 到 100 倍 G 下将过滤溶液离心一分钟。
在染色前，丢弃上一液，将颗粒重新在 10 毫升 PBS 中。下载图像 J 的斐济分发后，打开斐济并单击帮助、更新和管理更新网站。检查生物组和 IFPB 插件。
要下载依赖项插件，椭圆拆分和变形 lib J.然后单击关闭并应用更改。接下来，下载RStudio并打开它。将文本手稿中的代码复制到 RConsole 的命令行中，然后按 Enter。
然后键入 Y 以响应安装所有依赖项的所有提示。要执行图像量化，请打开斐济并拖动分析核化。py 进入状态栏。
当脚本编辑窗口打开时，单击左下角的运行。将弹出一个对话框，询问输出数据目录的位置。选择存储软件使用的所有分析数据、数字和其他数据的文件夹。
在分析参数中，选择要分析的图像的位置，并使用正则表达式输入图像文件名格式。选择所需设置后，单击"确定"。当来自分析管道不同阶段的图像出现在屏幕上时，检查它们以确保阈值和分段正确发生。打开分析器。
r 在 Rstudio 。接下来，在变量命名文件夹名称上，键入文件路径到最后一步中选定的输出数据文件夹，而不使用最终斜杠。单击脚本编辑窗口左上角的运行应用。
使用滑块为最小有效核平均强度阈值、最小有效核区域阈值和心肌细胞的最大有效最小雪铁龙直径设置阈值。向下滚动并单击应用所选阈值，然后单击绘图强度分布，这将呈现整个样本的原子核强度分布图以及每个分组变量的单独子图。要考虑样本内变异，请向下滚动并按组分别检查规范化，然后单击计算 ploidy 并绘制估计的 ploid 分布。
一旦规范化的整个样本图出现，两个峰值模式应可见。使用滑块并选择阈值来隔离二倍体和四倍位峰以及离群值。然后向下滚动并单击计算倍体和成核。
最后，单击按钮绘图并保存到结果文件夹中。此方法可用于分离均匀奇异的心肌细胞，这些心肌细胞相对纯净，不会污染细胞。它易于实现，并提供一致的心肌细胞产量和质量从不同的隔离。
使用该协议分离的心肌细胞可以使用抗体和氟铬结合的 azides 进行染色。为了显示沙康的特征Z线染色模式，细胞被染色的抗体识别α作用素。在另一项实验中，EdU在分离固定心肌细胞之前被给小鼠施用。
分离后，检测出经过S相的单核、二元化和三核心肌细胞。为了识别单个核，根据强度对原始DNA染色图像进行阈值。椭圆适合核掩码，分割单个核。
接下来，图像的像素根据其最近的椭圆划分为区域，这些领土的边界用于通过核星团绘制线。类似的分割过程被用来检测心肌细胞。这种分割策略表明，来自新生小鼠的大多数心肌细胞是单核的。
单核心肌细胞的频率在两周大的小鼠中要低得多，它们占心肌细胞总数的25%左右。当测量心肌细胞内单个核的倍体状态时，在幼鼠中检测到四倍核的较高频率。当隔离心肌细胞时，重要的是要验证所有细胞团体已经分解掉它们的三角。
