多能干细胞人类巨噬细胞的产生与表征

人类巨噬细胞生物学研究一直受到限制，因为它依赖于从捐赠者那里收集细胞。该协议显示了一种方法，我们可以在实验室中利用多能干细胞产生人类巨噬细胞。这是一个强大的协议，可以扩大生产巨噬细胞大量的细胞治疗或研究。

多能干细胞可以进行基因操纵。因此，在该协议中，我们可以生成具有特定表型、荧光标记和巨噬细胞的巨噬细胞来模拟疾病状态。此协议的可视化演示很有用，因为使用简单的通道工具对许多研究人员来说并不熟悉。

此外，补充介质和收获细胞时需要的护理水平很难用语言表达。当培养细胞达到80%的汇合时，用1.5毫升的新鲜培养剂取代已花的培养培养介质。单手握住培养容器，将一次性细胞传通工具滚动到板上一个方向。

滚轮中的所有刀片必须接触板。滚动时保持均匀的压力。在同一方向重复滚动，直到整个井被覆盖。

旋转培养容器 90 度并重复滚动。使用无菌移液器，使用井中的介质来移出切割菌落。吸气 CELLstart 并更换介质。

将细胞以一比四的比例转移到手稿中描述的预涂层井上。要在零日开始分化过程，将第一阶段介质的2.25毫升加入超低附着六孔板的两口井中。然后，对于六井板中一个 80% 的 iPCs 汇合井，用 1.5 毫升的一级介质更换维护介质。

使用新的细胞传通工具切割菌落。使用移液器，将切割菌落转移到超低附着六孔板的两口井中。第二天，通过将0.5毫升的hESC SFM介质加入包含第二天胚胎体六井板来调节细胞因子浓度。

第四天，用0.1%的明胶涂覆六孔组织培养板的四口井。孵育至少10分钟后，取出明胶，并加入2.5毫升的二期介质。从六孔板的两口井中收集成形的胚胎体，并把它们放在50毫升的离心管中。

允许它们通过重力在管子底部沉淀。然后小心地从管子中吸出介质，并在第二阶段介质的两毫升中重新暂停胚胎体。将10至15个胚胎体转移到含有2.5毫升二期介质的明胶涂层井中，并在37摄氏度下孵育，二氧化碳含量为5%。

在两到三周内，每三到四天更换一次媒体。电镀 EB 至关重要。少于 10 个或超过 15 个 15 EB 或分布不均会导致巨噬细胞产量低。

两到三周后，胚胎体开始释放非硬性造血细胞进入悬浮状态。使用40微米过滤器，收集这些细胞到50毫升管，然后补充介质。将造血细胞的悬浮液在200倍g下离心三分钟。

在第三阶段介质中重新吸血造血细胞。然后将细胞的密度为每毫升0.2倍10至第六细胞。每五天更换一次三台介质。

9至11天后，巨噬细胞将完全分化和全功能。将八倍 10 添加到第四个 iPSC 衍生的巨噬细胞中，将三阶段介质的 200 微升添加到 96 井板的每个井中。向每一个包含 iPSC 衍生巨噬细胞的井中加入 100 微升珠溶液。

使用高含量成像系统对板进行成像。在每个井上获取三个或更多字段，以获得良好的表示形式。iPSC菌落、胚胎体、造血悬浮细胞和成熟的巨噬细胞在形态上是截然不同的。

iPSC衍生的巨噬细胞很大，有单个小椭圆形核，并含有丰富的细胞质，含有许多囊泡。通过流细胞学评估巨噬细胞表型。成熟的 iPSC 衍生巨噬细胞表示血统标记 CD45 和巨噬细胞成熟标记 25F9，对单细胞不成熟巨噬细胞标记 CD93 呈阴性。

iPSC衍生巨噬细胞表示几种血统骨髓标记，对免疫调节标记CD86呈阳性。一小部分巨噬细胞表示化疗素受体CX3CR1、CCR2、CCR5和CCR8。利用生物粒子和高含量成像系统对 iPSC-DM 噬菌学能力进行了评估。

生物粒子在加入巨噬细胞培养物时是非荧光的，但在噬菌体发后，在细胞内酸性pHS中荧光明亮的绿色。噬细胞分数表示噬菌体生物粒子的巨噬细胞比例，噬菌体指数是衡量每个巨噬细胞摄入的生物粒子数量。巨噬细胞可以改变表型，以响应环境线索。

RT-PCR用于量化基因的上调节mRNA表达。与天真的巨噬细胞相比，用LPS和干扰素伽马或IL4治疗的巨噬细胞显示噬菌体百分比明显较低。用IL10治疗的巨噬细胞显示噬菌体百分比增加，噬菌体指数增加。

该协议可用于提供现成的细胞来源，用于治疗慢性肝病等疾病，其中巨噬细胞已被证明在动物模型中具有治疗作用。iPSC衍生的巨噬细胞可用于研究与几种疾病状态相关的巨噬细胞。例如，我们使用这些细胞来研究与乳腺癌肿瘤相关的巨噬细胞。

我们使用称为KLF1的单一转录因子，通过基因编程，修改了 iPSC 衍生巨噬细胞的表型。有了这个，我们产生了看起来像红细胞岛巨噬细胞的巨噬细胞，它们为红血球的产生和成熟提供了见解。