双子宫电穿孔是研究哺乳动物皮质生成的重要方面，如神经元细胞之间的相互作用，在不同位置和发育年龄产生的有力方法。这种技术的主要优点是能够以快速、详细和廉价的方式检查这些不同细胞群之间的不受干扰的相互作用。我们方法的一个显著含义是，它有助于更好地了解我们的接线在孤独症和精神分裂症等神经元疾病中是如何变化的。
这项研究不仅限于新皮质，但它也可用于分析细胞与细胞的相互作用，在外皮质区域，如囊性或小脑。最具挑战性的步骤之一是将DNA注射到早期胚胎的横向心室。使用明亮的光源对于成功注射至关重要。
对于每个手术，首先准备一个10微升溶液，其中包含一微升的快速绿色染料，每微升质粒DNA溶液1微克，每个质粒感兴趣的，以及适当的体积内毒素无TE缓冲液。并预装玻璃微胶囊移液器与适当准备的DNA溶液。对于子宫电穿孔手术中的第一个，在适当时间麻醉的怀孕小鼠的眼睛上涂抹软膏，并使用剃须刀剃光腹部。
在腹部右侧进行切口之前，使用连续的70%乙醇和碘湿巾对裸露的皮肤进行两次消毒。一旦子宫被访问使用环钳仔细提取器官。使用口腔控制的吸气管，将大约0.5微升溶液注射到E11.5胚胎左半球的侧心室，用于策略 A.或注射到E13.5胚胎右半球的侧心室，用于策略B，直到心室内可见快速的绿色染料。
当所有溶液都注射后，将钳子在注射胚胎头部的侧向周围放置钳子，将正极定向到中壁，以定位策略 A 的皮质下摆，或定向到策略 B 的侧皮层，注意避开心脏和胎盘。使用方波电波电波器为每个胚胎年龄应用适当的电脉冲序列，如表中所示。当所有胚胎都经过注射和电穿孔后，使用钳子小心地将子宫返回到腹腔，并在腹部充满温暖的盐水。
使用针6-0缝合，关闭腹壁，并小心关闭皮肤切口。然后将动物返回到其家庭笼子进行监测，直到完全恢复。在最初的手术两天后，确认小鼠表现出正常行为，并且没有疼痛或不适的迹象。
在准备动物的第二个子宫电穿孔之前， 刚才证明。将所需DNA溶液的0.5微升注入E13.5胚胎的左侧脑心室，用于策略B;每次注射后，将正极的电极向注射半球的侧皮层放置，用于策略B和策略B。以及表所示的电相胚胎。电穿孔完成后，将子宫返回到腹腔，并完成手术和手术后护理，如证明。
在实施策略 A 时，在第二次电穿孔后四天，将胚胎日17.5怀孕雌性小鼠的子宫收获成冰上 PBS 的培养皿。在解剖显微镜下，用钳子将胚胎移植到PBS的新盘中。使用钳子，小心地抓住每个胚胎的头部，以方便去除头部和头骨上的皮肤。
使用钳子或铲子将暴露的大脑抬出。然后用勺子将每个大脑转移到一个48孔板的单个孔中，每个井含有大约600微升的固定溶液。当所有的大脑被收集起来后，在轨道摇床上一夜之间将大脑固定在摄氏四度，然后用PBS进行三次十分钟的洗涤。
上次洗涤后，将大脑嵌入4%的低熔点，在PBS中约10分钟。凝固后，使用氰丙烯酸酯胶将每个大脑固定到振动组织支架嗅球侧向上。将支架放在振动容器内，然后用 PBS 填充容器。
然后使用振动器和刷子获得 100 微米厚的日冕序列段。每孔最多转移7个部分，每个胚胎6个孔，在一个新的48孔板中，每孔含有600微升的新鲜PBS，在收集时辅以抗真菌防腐剂。获得所有部分后，使用细毛刷将每个截面安装到玻璃显微镜幻灯片上，并用玻璃盖玻片盖住它们，以评估直立荧光显微镜上的电穿孔效果。
在实施策略B时，在产后第15天，在确认对针头缺乏反应后，将鼠标固定在上针位置，并使用剪刀制作中线皮肤切口，露出肋骨和隔膜，并切开隔膜以进入心脏。使用精细剪刀，在右心房内做一个切口，并使用连接到柔性管的25个精袋针到渗透灌注泵穿透左心室。当针头就位时，通过转心灌注，以每分钟5.5毫升的恒定通量，提供至少25毫升4%的对甲醛。
大约五分钟后，停止灌注，并使用剪刀去除头部的皮肤。取出头骨，用铲子取出脑组织。将大脑放入含有1.5毫升新鲜4%甲醛的24井板的一个井中，在轨道摇床上4摄氏度的夜间孵育。
然后获得40微米的产后大脑部分，正如刚刚证明的。对于胚胎和产后脑片成像，将包含感兴趣的安装大脑部分的幻灯片放在显微镜幻灯片支架上。在共体显微镜中引入滑块支架，并选择实验中使用的氟化物的适当通道。
执行样本扫描，以获取两种不同波长的每个大脑部分的地图图像，以便对双电穿孔输出进行一般查看。完成后，选择 10 倍镜头，在多区域 Z 堆栈时间差观察模式下。在每个选择的 XY 区域中，根据样品的平面设置适当的成像周长以及沿 Z 轴的扫描深度，其中荧光可见。
获取所有选定区域的低放大倍率图像，并在显微镜查看器软件中将图像从 OIF 导出为 TIFF 格式。然后选择 60 倍镜头，并像刚才演示的一样捕获高放大倍率图像，以更详细的方式观察细胞到细胞的交互。子宫电穿孔手术的双重时间差距使CAG在胚胎第11.5天的目标细胞到达横向新皮质的边际区域，包括躯体感觉区，及时与皮质投影神经元建立接触，标记在胚胎日13.5。
投影神经元表达增强的GP在皮层边缘区域大量上升，并与M-cherry表达猫部细胞的过程进行交联。在胚胎第13.5天的子宫电穿孔中，使用BFP表达质粒有助于不同皮质层投影神经元的标签。胚胎第15.5天反侧的第二次电穿孔针对的是上层细胞投影神经元亚群，而不是早期发育的下层投影神经元。
上层目标神经元将其轴突扩展到反边半球，具有特征的轴化模式。高放大倍率允许更详细地可视化反边半球内目标投影神经元的角轴体内化。在尝试此协议时，必须根据要定位的细胞群规划电穿孔时间、注射半球以及电极的位置。
遵循这个程序的所有方法，如电穿孔是有趣的一个。对于两种细胞类型，可以执行研究体内可能的电路变化。使用这种技术，可以研究两个不同的靶细胞之间的精细相互作用。
包括体内新的科学信息，通过荧光突触蛋白的电穿孔。
