כפול אלקטרופורציה ברחם היא שיטה רבת עוצמה לחקר ההיבטים החשובים של קורטיקוגניזה יונקים כגון האינטראקציה בין תאי נוירון, שנוצר במקומות שונים וגילאים התפתחותיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת לבחון אינטראקציות ללא הפרעה בין אוכלוסיות תאים שונות אלה באופן מהיר, מפורט וזול. אחת ההשלכות הבולטות של השיטה שלנו היא שהיא מאפשרת הבנה טובה יותר של האופן שבו החיווט שלנו דומה בהפרעות עצביות כמו אוטיזם וסכיזופרניה.
מחקר זה אינו מוגבל neocortex אבל זה יכול להיות מועסק גם כדי לנתח תאים לתא אינטראקציות, באזורים exocortico כגון sepalium או המוח הקטן. אחד הצעדים המאתגרים ביותר הוא הזרקת דנ"א לחדרים האובריים של עוברים מוקדמים. השימוש במקור אור בהיר חיוני לזריקות מוצלחות.
עבור כל ניתוח להכין תחילה פתרון 10 microliter המכיל מיקרוליטר אחד של צבע ירוק מהיר, מיקרוגרם אחד לכל פתרון DNA פלסמיד microliter מעניין עבור כל פלסמיד, ואת הנפח המתאים על מאגר TE חינם אנדוטוקסין. ותטען מראש פיפטה מיקרו-אקפילרית מזכוכית עם תמיסת הדנ"א המוכנה המתאימה. לראשונה בניתוח אלקטרופורציה ברחם, יש למרוח משחה על עיניו של עכבר הרדמה מתוזמן כראוי, ולהשתמש בתער כדי לגלח את הבטן.
לחטא את העור החשוף פעמיים עם רציף 70% אתנול ומגבוני יוד לפני שתמשיך עם החתך בצד ימין של הבטן. לאחר הרחם נגיש להשתמש מטחני טבעת כדי לחלץ בזהירות את האיבר. באמצעות צינור שאספירטור מבוקר בפה, להזריק כ 0.5 microliters של פתרון לתוך החדר הרוחבי של חצי הכדור השמאלי של E11.5 עוברים לאסטרטגיה A.Or לתוך החדר הרוחבי של חצי הכדור הימני של E13.5 עוברים לאסטרטגיה B, עד הצבע הירוק המהיר גלוי בתוך החדר.
כאשר כל הפתרון הוזרק, מניחים מלקחי סוג אלקטרודות פלטינה באופן צידי סביב ראש העוברים המוזרקים, כאשר המוט החיובי מכוון לקיר המדיאלי כדי למקד את מכפלת קליפת המוח לאסטרטגיה A, או מכוון לקליפת המוח הצדדית לאסטרטגיה B, דואג להימנע מהלב והשליה. השתמש אלקטרופורטר גל מרובע כדי להחיל את הרצף המתאים של פולסים חשמליים עבור כל גיל עוברי, כפי שצוין בטבלה. כאשר כל העוברים הוזרקו ואלקטרופולדו, השתמש במלקיחות כדי להחזיר בזהירות את הרחם לחלל הבטן, ולמלא את הבטן עם מלוחים חמים.
באמצעות תפר מחט 6-0, לסגור את דופן הבטן, ולסגור בזהירות את חתך העור. ואז להחזיר את החיה לכלוב הבית שלה עם ניטור עד החלמה מלאה. יומיים לאחר הניתוח הראשוני, ודאו שהעכבר מפגין התנהגות תקינה, ולא מציג סימנים לכאב או מצוקה.
לפני הכנת החיה לשניה באלקטרופוריה ברחם כפי שהוכח זה הרגע. להזריק 0.5 microliters של פתרון ה-DNA הרצוי לתוך החדר המוחי בצד שמאל של E13.5 עוברים לאסטרטגיה A, ולתוך החדר המוח הרוחבי השמאלי של E15.5 עוברים לאסטרטגיה B.After כל זריקה, למקם את האלקטרודות עם מוט חיובי מכוון קליפת המוח הרוחבית של חצי הכדור מוזרק לאסטרטגיה A ואסטרטגיה B.And אלקטרופורת עוברים כפי שצוין בטבלה. כאשר האלקטרופוריה הסתיימה, להחזיר את הרחם לחלל הבטן, ולהשלים את הניתוח ואת הטיפול שלאחר הניתוח כפי שהוכח.
בעת יישום אסטרטגיה A, ארבעה ימים לאחר האלקטרופוריה השנייה, לקצור את הרחם של היום העוברי 17.5 עכבר נקבה בהריון לתוך צלחת פטרי של PBS על קרח. ולהשתמש פינצטה כדי להעביר את העוברים לתוך צלחת חדשה של PBS תחת מיקרוסקופ ניתוח. באמצעות מדחס, בזהירות לתפוס את הראש של כל עובר כדי להקל על הסרת העור מעל הראש והגולגולת.
השתמש במפולות או מרית כדי להרים את המוחות החשופים. לאחר מכן השתמש בכפית כדי להעביר כל מוח לתוך בארות בודדות של צלחת 48 באר המכיל סביב 600 microliters של פתרון קיבוע לגם. כאשר כל המוחות נאספו, לתקן את המוח בארבע מעלות צלזיוס לילה על שייקר מסלולית, ואחריו שלוש עשר דקות שטיפות PBS.
לאחר הכביסה האחרונה, להטמיע את המוח ב 4% נקודת התכה נמוכה התעוררה PBS במשך כעשר דקות. לאחר שהתעוררות התגבשה, השתמש בדבק ציאנואקרילאט כדי לאבטח כל מוח למחזיק רקמת רטט בצד הנורה חוש הריח למעלה. מניחים את המחזיק בתוך מיכל הרטט, וממלאים את המיכל ב- PBS.
לאחר מכן השתמש ברטט ומברשת כדי להשיג 100 חלקים טוריים קורונדל עבה מיקרומטר. העברה של עד שבעה חלקים לבירה ושש בארות לעובר, בצלחת חדשה של 48 בארות המכילה 600 מיקרוליטרים לבירה של PBS טרי, בתוספת חומרים משמרים אנטי פטרייתיים כפי שהם נאספים. כאשר כל החלקים נרכשו, השתמש במברשת עדינה כדי להרכיב כל קטע על מגלשת מיקרוסקופ זכוכית, ולכסות אותם עם כיסוי זכוכית להערכת יעילות האלקטרופוזיה על מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי זקוף.
בעת יישום אסטרטגיה B, ביום שלאחר הלידה 15, לאחר אישור חוסר תגובה topinch, לאבטח את העכבר במצב supine, ולהשתמש מספריים לעשות חתך בעור קו האמצע לחשוף את הצלעות ואת הסרעפת, לחתוך את הסרעפת כדי לקבל גישה ללב. באמצעות מספריים עדין, לעשות חתך ב אטריום הימני, ולהשתמש מחט 25 gage מחובר צינור גמיש משאבת זלוף peristaltic לחדור החדר השמאלי. כאשר המחט נמצאת במקום, לספק לפחות 25 מיליליטר של 4% paraformaldehyde על ידי זלוק transcardial, בשטף קבוע ב 5.5 מיליליטר לדקה.
לאחר כחמש דקות, לעצור את תדלוק, ולהשתמש מספריים כדי להסיר את העור מעל הראש. הסר את הגולגולת, ולהשתמש מרית כדי להסיר את רקמת המוח. מניחים את המוח לתוך באר אחת של צלחת 24 באר המכיל 1.5 מיליליטר של טרי 4% paraformaldehyde, עבור דגירה לילה בארבע מעלות צלזיוס על שייקר מסלולית.
לאחר מכן לרכוש 40 חלקים מיקרומטר של המוח לאחר הלידה כפי שהוכח רק. להדמיית פרוסת מוח עוברית ולאחר לידה, מקם את השקופיות המכילות את חלקי המוח המותקנים של עניין על מחזיק שקופית מיקרוסקופ. הציגו את מחזיק המחוון במיקרוסקופ הקונפוקל ובחרו את הערוץ המתאים לפלואורופורים המשמשים בניסוי.
בצע סריקה לדוגמה כדי להשיג תמונות מפה של כל קטע במוח בשני אורכי גל שונים לתצוגה כללית של פלט האלקטרופולציה הכפולה. לאחר שתסיים, בחר את העדשה 10x, במצב תצפית לשגות זמן מחסנית Z מרובה שטחים. בכל אחד מאזורי ה- XY הנבחרים, הגדר את היקפי ההדמיה המתאימים וכן את עומק הסריקה לאורך ציר Z בהתאם למישורי המדגם, שבהם הפלואורסצנטיות גלויה.
השג תמונות הגדלה נמוכה של כל האזורים שנבחרו, וייצא את התמונות מ- OIF לפורמט TIFF בתוכנת מציג המיקרוסקופ. לאחר מכן בחר את עדשת 60x, וללכוד תמונות הגדלה גבוהה כפי שהודגם זה בלבד, כדי לבחון את האינטראקציות בין תא לתא ברמה מפורטת יותר. הפער הזמני בין הכפול בניתוחי אלקטרופורציה ברחם מאפשר לתאי טורסיאליים CAG הממוקדים ביום העוברי 11.5 באחד ממקומות המוצא שלו להגיע לאזור השולי של הניאוקורטקס הצדדי כולל האזור סומטוסנסורי, בזמן כדי ליצור קשרים עם נוירונים הקרנה קליפת המוח, שכותרתו ביום העוברי 13.5.
התהליכים המובילים של נוירוני הקרנה המבטאים עליות GFP משופרות בשפע באזור השולי של קליפת המוח, ומתמזגים עם התהליכים של M-דובדבן המבטאים תאים קטרציאליים. ב אלקטרופורציה ברחם ביום עוברי 13.5, באמצעות BFP המביע פלסמיד מקל על תיוג של נוירוני הקרנה על פני שכבות קליפת המוח שונות. אלקטרופורציה שנייה בצד ההפוכה של היום העוברי 15.5 מכוונת תת-התת-תפוקה של השכבה העליונה של ההקרנה, אך לא לנוירונים של הקרנה בשכבה התחתונה המתפתחים בשלבים מוקדמים יותר.
השכבה העליונה ממוקדת נוירונים להרחיב את האקסונים שלהם אל חצי הכדור ההפוך, עם דפוס arborization אופייני. הגדלה גבוהה מאפשרת הדמיה מפורטת יותר של פנימיות אקסון קליוסאלית של נוירוני ההקרנה הממוקדים בתוך חצי הכדור ההפוכה. בעת ניסיון פרוטוקול זה, חשוב לתכנן תזמון אלקטרופורציה, חצי הכדור להזריק, ואת המיקום של האלקטרודות על פי אוכלוסיות התא להיות ממוקד.
בעקבות הליך זה כל השיטות, כגון אלקטרופורציה היא מעניינת. עבור שני סוגי התאים ניתן לבצע כדי ללמוד שינויים אפשריים במעגל vivo. באמצעות טכניקה זו, ניתן ללמוד אינטראקציות בסדר בין שני תאים ממוקדים שונים.
כולל מידע מדעי חדש ב-vivo, על ידי אלקטרופוזיה של חלבונים סינפטיים פלואורסצנטיים.
