La electroporación doble en el útero es un método potente para estudiar los aspectos importantes de la corticogénesis de los mamíferos, como la interacción entre las células de las neuronas, generada en diferentes lugares y edades de desarrollo. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de examinar las interacciones no perturbadas entre estas diferentes poblaciones celulares de una manera rápida, detallada y económica. Una implicación sorprendente de nuestro método es que facilita una mejor comprensión de lo similar que se altera nuestro cableado en trastornos neuronales como el autismo y la esquizofrenia.
Este estudio no se limita al neocórtex, pero también se puede emplear para analizar las interacciones de células a células, en áreas excorticos como el sepalium o el cerebelo. Uno de los pasos más desafiantes es la inyección de ADN en los ventrículos laterales de los embriones tempranos. El uso de una fuente de luz brillante es esencial para inyecciones exitosas.
Para cada cirugía primero preparar una solución de 10 microlitros que contenga un microlitro de tinte verde rápido, una solución de ADN de plásmido de un microgramo por microlitros de interés para cada plásmido, y el volumen adecuado en tampón TE libre de endotoxinas. Y precargar una pipeta microcapilar de vidrio con la solución de ADN preparada adecuada. Para la primera cirugía de electroporación del útero, aplique un ung ón en los ojos de un ratón embarazada anestesiado apropiadamente, y use una maquinilla de afeitar para afeitar el abdomen.
Desinfectar la piel expuesta dos veces con toallitas secuenciales de etanol y yodo antes de continuar con la incisión en el lado derecho del abdomen. Una vez que el útero es accesible utilizar fórceps de anillo para extraer cuidadosamente el órgano. Usando un tubo aspirador controlado por la boca, inyecte aproximadamente 0,5 microlitros de solución en el ventrículo lateral del hemisferio izquierdo de los embriones E11.5 para la estrategia A.Or en el ventrículo lateral del hemisferio derecho de los embriones E13.5 para la estrategia B, hasta que el tinte verde rápido sea visible dentro del ventrículo.
Cuando se haya inyectado toda la solución, coloque los electrodos de platino tipo fórceps lateralmente alrededor de la cabeza de los embriones inyectados, con el polo positivo orientado a la pared medial para apuntar al dobladillo cortical para la estrategia A, o orientado a la corteza lateral para la estrategia B, teniendo cuidado de evitar el corazón y la placenta. Utilice un electroporáter de onda cuadrada para aplicar la secuencia adecuada de pulsos eléctricos para cada edad embrionaria, como se indica en la tabla. Cuando todos los embriones se hayan inyectado y electroporado, utilice fórceps para devolver cuidadosamente el útero a la cavidad abdominal y llene el abdomen con solución salina tibia.
Usando una sutura de aguja 6-0, cierre la pared abdominal y cierre cuidadosamente la incisión de la piel. A continuación, devolver el animal a su jaula de origen con monitoreo hasta la recuperación completa. Dos días después de la cirugía inicial, confirme que el ratón está exhibiendo un comportamiento normal y no presenta signos de dolor o angustia.
Antes de preparar al animal para el segundo en electroporación del útero como acabamos de demostrar. Inyectar 0,5 microlitros de la solución de ADN deseada en el ventrículo cerebral lateral izquierdo de los embriones E13.5 para la estrategia A, y en el ventrículo cerebral lateral izquierdo de los embriones E15.5 para la estrategia B.Después de cada inyección, coloque los electrodos con el polo positivo orientado a la corteza lateral del hemisferio inyectado para la estrategia A y la estrategia B.y electroporates como se indica en el embrión. Cuando termine la electroporación, devuelva el útero a la cavidad abdominal y complete la cirugía y la atención postquirúrgica como se ha demostrado.
Al implementar la estrategia A, cuatro días después de la segunda electroporación, cosechar el útero del día embrionario 17.5 ratón hembra embarazada en un plato petri de PBS en hielo. Y usa pinzas para transferir los embriones a un nuevo plato de PBS bajo un microscopio diseccionado. Usando fórceps, agarre cuidadosamente la cabeza de cada embrión para facilitar la extracción de la piel sobre la cabeza y el cráneo.
Use fórceps o una espátula para sacar los cerebros expuestos. A continuación, utilice la cuchara para transferir cada cerebro a pozos individuales de un plato de 48 pozos que contiene alrededor de 600 microlitros de solución fijadora por pozo. Cuando todos los cerebros han sido recogidos, fija los cerebros a cuatro grados Celsius durante la noche en un agitador orbital, seguido de tres lavados de diez minutos en PBS.
Después del último lavado, incruste los cerebros en un punto de fusión 4%bajo agarosa en PBS durante unos diez minutos. Después de que la agarosa se haya solidificado, utilice pegamento de cianoacrilato para asegurar cada cerebro a un soporte de tejido vibratomo oxifa bulbo olfativo hacia arriba. Coloque el soporte dentro del recipiente del vibratomo y llene el recipiente con PBS.
A continuación, utilice el vibratome y un cepillo para obtener secciones seriales coronales de 100 micrómetros de espesor. Transferencia de hasta siete secciones por pozo y seis pozos por embrión, en una nueva placa de 48 pozos que contiene 600 microlitros por pozo de PBS fresco, complementado con conservantes antifúngicos a medida que se recogen. Una vez adquiridas todas las secciones, utilice un cepillo fino para montar cada sección en un portaobjetos de microscopio de vidrio y cúbralas con un cubreobjetos de vidrio para evaluar la eficacia de la electroporación en un microscopio de epifluorescencia vertical.
Al implementar la estrategia B, en el día posnatal 15, después de confirmar la falta de respuesta a topinch, asegurar el ratón en la posición supina, y utilizar tijeras para hacer una incisión de la piel de la línea media para exponer la caja torácica y el diafragma, y cortar el diafragma para obtener acceso al corazón. Usando tijeras finas, haz una incisión en la aurícula derecha y usa una aguja de 25 gage conectada a un tubo flexible a una bomba de perfusión peristáltica para penetrar en el ventrículo izquierdo. Cuando la aguja esté en su lugar, entregue al menos 25 mililitros de 4%paraformaldehído por perfusión transcardial, a un flujo constante a 5,5 mililitros por minuto.
Después de aproximadamente cinco minutos, detenga la perfusión y use tijeras para eliminar la piel sobre la cabeza. Retire el cráneo y use una espátula para extraer el tejido cerebral. Coloque el cerebro en un pozo de una placa de 24 pozos que contenga 1,5 mililitros de 4%paraformaldehído fresco, para una incubación nocturna a cuatro grados centígrados en un agitador orbital.
A continuación, adquirir 40 secciones de micrómetros de los cerebros postnatales como acaba de demostrar. Para las imágenes embrionarias y postnatales de la rebanada cerebral, coloque las diapositivas que contienen las secciones cerebrales montadas de interés en un portaobjetos del microscopio. Introducir el soporte deslizante en el microscopio confocal y seleccionar el canal adecuado para los fluoroforos utilizados en el experimento.
Realice el escaneo de muestras para obtener imágenes de mapa de cada sección cerebral en dos longitudes de onda diferentes para obtener una vista general de la salida de electroporación doble. Una vez terminado, seleccione la lente 10x, en el modo de observación de lapso de tiempo de pila Z multiárea. En cada una de las regiones XY seleccionadas, establezca los perímetros de imagen adecuados, así como la profundidad del escaneo a lo largo del eje Z de acuerdo con los planos de la muestra, en los que la fluorescencia es visible.
Obtenga imágenes de bajo aumento de todas las regiones elegidas y exporte las imágenes de OIF al formato TIFF en el software del visor del microscopio. A continuación, seleccione la lente 60x y capture imágenes de alto aumento como se acaba de demostrar, para observar las interacciones de celda a celda a un nivel más detallado. La brecha temporal entre el doble en las cirugías de electroporación del útero permite que las células toresiales CAG dirigidas en el día embrionario 11.5 en uno de sus lugares de origen lleguen a la zona marginal del neocórtex lateral incluyendo el área somatosensorial, a tiempo para establecer contactos con neuronas de proyección cortical, etiquetadas el día embrionario 13.5.
Los principales procesos de las neuronas de proyección que expresan un aumento profusa de la GFP mejorada en la zona marginal de la corteza, y se entremezclan con los procesos de M-cherry que expresan las células cataretales. En la electroporación del útero en el día embrionario 13.5, el uso de un plásmido de BFP que expresa el plásmido facilita el etiquetado de las neuronas de proyección a través de diferentes capas corticales. Una segunda electroporación en el lado contralateral del día embrionario 15.5 se dirige a la subpoblación de las neuronas de proyección callosal de capa superior, pero no a las neuronas de proyección de capa inferior que se desarrollan en etapas anteriores.
Las neuronas dirigidas de capa superior extienden sus axones al hemisferio contralateral, con el patrón de arborización característico. El alto aumento permite una visualización más detallada de la inervación del axón callosal de las neuronas de proyección dirigidas dentro del hemisferio contralateral. Al intentar este protocolo, es importante planificar la sincronización de electroporación, el hemisferio para inyectar, y la posición de los electrodos de acuerdo con las poblaciones celulares a ser objetivo.
Siguiendo este procedimiento todos los métodos, como la electroporación es el interesante. Para ambos tipos de células se puede realizar para estudiar posibles alteraciones del circuito in vivo. Usando esta técnica, es posible estudiar interacciones finas entre dos células dirigidas diferentes.
Incluyendo nueva información científica in vivo, por la electroporación de proteínas sinápticas fluorescentes.
