Double in utero Elektroporation ist eine leistungsfähige Methode zur Untersuchung der wichtigen Aspekte der Säugetierkortikogenese wie die Interaktion zwischen Neuronenzellen, die an verschiedenen Orten und Entwicklungsaltern erzeugt werden. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Fähigkeit, ungestörte Wechselwirkungen zwischen diesen verschiedenen Zellpopulationen schnell, detailliert und kostengünstig zu untersuchen. Eine auffällige Implikation unserer Methode ist, dass sie ein besseres Verständnis dafür ermöglicht, wie ähnlich unsere Verdrahtung bei neuronalen Störungen wie Autismus und Schizophrenie verändert wird.
Diese Studie ist nicht auf den Neocortex beschränkt, aber es kann auch verwendet werden, um Zell-zu-Zell-Wechselwirkungen zu analysieren, in Exocortico-Bereichen wie dem Sepalium oder Kleinhirn. Einer der schwierigsten Schritte ist die Injektion von DNA in die seitlichen Ventrikel früher Embryonen. Die Verwendung einer hellen Lichtquelle ist für erfolgreiche Injektionen unerlässlich.
Für jede Operation bereiten Sie zunächst eine 10-Mikroliter-Lösung vor, die einen Mikroliter schnellen grünen Farbstoff, ein Mikrogramm pro Mikroliter Plasmid-DNA-Lösung enthält, die für jedes Plasmid von Interesse ist, und das entsprechende Volumen auf Endotoxin-freiem TE-Puffer. Und eine Mikrokapillarpipetten aus Glas mit der entsprechenden vorbereiteten DNA-Lösung vorladen. Für die erste in der Utero-Elektroporation-Chirurgie, tragen Salbe auf die Augen einer entsprechend getimten anästhesierten schwangeren Maus, und verwenden Sie ein Rasiermesser, um den Bauch zu rasieren.
Desinfizieren Sie die exponierte Haut zweimal mit sequenziellen 70%Ethanol- und Jodtüchern, bevor Sie mit dem Schnitt auf der rechten Seite des Bauches fortfahren. Sobald die Gebärmutter zugänglich ist, verwenden Sie Ringzange, um das Organ sorgfältig zu extrahieren. Mit einem mundgesteuerten Aspiratorrohr ca. 0,5 Mikroliter Lösung in den seitlichen Ventrikel der linken Hemisphäre von E11.5-Embryonen für Strategie A.Oder in die seitliche Herzkammer der rechten Hemisphäre von E13.5-Embryonen für Strategie B injizieren, bis der schnelle grüne Farbstoff innerhalb des Ventrikels sichtbar ist.
Wenn die gesamte Lösung injiziert wurde, legen Sie Zangen Typ Platinelektroden seitlich um den Kopf der injizierten Embryonen, mit dem positiven Pol an der medialen Wand ausgerichtet, um den kortikalen Saum für Strategie A zu zielen, oder orientiert sich an der seitlichen Kortex für Strategie B, wobei darauf geachtet wird, das Herz und die Plazenta zu vermeiden. Verwenden Sie einen vierwelligen Elektroporater, um die entsprechende Sequenz elektrischer Impulse für jedes embryonale Alter anzuwenden, wie in der Tabelle angegeben. Wenn alle Embryonen injiziert und elektroporated wurden, verwenden Sie Zangen, um die Gebärmutter vorsichtig in die Bauchhöhle zurückzuführen und den Bauch mit warmer Saline zu füllen.
Mit einer Nadel 6-0 Naht, schließen Sie die Bauchwand, und vorsichtig schließen Sie die Haut einschnitt. Dann bringen Sie das Tier in seinen Hauskäfig mit Überwachung bis zur vollständigen Genesung zurück. Zwei Tage nach der ersten Operation, bestätigen, dass die Maus normales Verhalten zeigt, und zeigt keine Anzeichen von Schmerzen oder Bedrängnis.
Vor der Vorbereitung des Tieres für die zweite in utero Elektroporation, wie gerade gezeigt. Injizieren Sie 0,5 Mikroliter der gewünschten DNA-Lösung in die linke seitliche Hirnkammer von E13.5-Embryonen für Strategie A und in die linke seitliche Hirnkammer von E15.5-Embryonen für Strategie B. Legen Sie nach jeder Injektion die Elektroden mit dem positiven Pol, der an der lateralen Kortex der injizierten Hemisphäre für Strategie A und Strategie B.Und Elektroporate-Embryonen orientiert ist, wie in der Tabelle angegeben, auf. Wenn die Elektroporation abgeschlossen ist, kehren Sie die Gebärmutter in die Bauchhöhle zurück und schließen Sie die Operation und postoperative Versorgung ab, wie gezeigt.
Bei der Umsetzung von Strategie A, vier Tage nach der zweiten Elektroporation, ernten Sie die Gebärmutter des embryonalen Tages 17.5 schwangere weibliche Maus in eine Petrischale von PBS auf Eis. Und verwenden Sie pinzette, um die Embryonen in eine neue Schale von PBS unter einem Sezieren Mikroskop zu übertragen. Mit Zangen, sorgfältig greifen Sie den Kopf jedes Embryos, um die Entfernung der Haut über den Kopf und Schädel zu erleichtern.
Verwenden Sie Zangen oder einen Spachtel, um die exponierten Gehirne zu heben. Dann verwenden Sie Löffel, um jedes Gehirn in einzelne Brunnen einer 48-Well-Platte mit rund 600 Mikroliter fixative Lösung pro Brunnen zu übertragen. Wenn alle Gehirne gesammelt wurden, fixieren Sie die Gehirne bei vier Grad Celsius über Nacht auf einem Orbital-Shaker, gefolgt von drei zehnminütigen Wälzungen in PBS.
Nach der letzten Wäsche, betten Sie das Gehirn in 4%niedrigen Schmelzpunkt Agarose in PBS für etwa zehn Minuten. Nachdem die Agarose erstarrt ist, verwenden Sie Cyanoacrylat-Kleber, um jedes Gehirn zu einem Vibratom Gewebehalter Olfaktor-Lampe Seite nach oben zu sichern. Legen Sie den Halter in den Vibrambehälter und füllen Sie den Behälter mit PBS.
Verwenden Sie dann das Vibratome und eine Bürste, um 100 Mikrometer dicke koronare serielle Abschnitte zu erhalten. Übertragung von bis zu sieben Abschnitten pro Brunnen und sechs Brunnen pro Embryo, in einer neuen 48-Well-Platte mit 600 Mikroliterpro-Brunnen von frischem PBS, ergänzt mit Anti-Pilz-Konservierungsstoffen, wie sie gesammelt werden. Wenn alle Abschnitte erworben sind, verwenden Sie eine feine Bürste, um jeden Abschnitt auf einem Glasmikroskopschlitten zu montieren, und bedecken Sie sie mit einem Glasdeckel, um die Wirksamkeit der Elektroporation auf einem aufrechten Epifluoreszenzmikroskop zu beurteilen.
Bei der Umsetzung der Strategie B, am postnatalen Tag 15, nach der Bestätigung eines Mangels an Reaktion auf Topinch, sichern Sie die Maus in der Supine-Position, und verwenden Sie eine Schere, um einen Mittellinien-Hautschnitt zu machen, um den Brustkorb und Das Zwerchfell zu belichten, und schneiden Sie das Zwerchfell, um Zugang zum Herzen zu erhalten. Mit feiner Schere, machen Sie einen Schnitt im rechten Vorhof, und verwenden Sie eine 25-gage Nadel mit einem flexiblen Rohr mit einer peristaltischen Perfusionspumpe verbunden, um die linke Herzkammer zu durchdringen. Wenn die Nadel an Ort und Stelle ist, liefern Sie mindestens 25 Milliliter 4%paraformaledehyd durch transkardiale Perfusion, bei einem konstanten Fluss bei 5,5 Milliliter pro Minute.
Nach etwa fünf Minuten, stoppen Sie die Perfusion, und verwenden Sie eine Schere, um die Haut über dem Kopf zu entfernen. Entfernen Sie den Schädel, und verwenden Sie einen Spachtel, um das Gehirngewebe zu entfernen. Legen Sie das Gehirn in einen Brunnen einer 24-Brunnenplatte mit 1,5 Milliliter frischem 4%Paraformaldehyd, für eine nächtliche Inkubation bei vier Grad Celsius auf einem Orbital-Shaker.
Dann erwerben 40 Mikrometer Abschnitte der postnatalen Gehirne, wie gerade gezeigt. Für embryonale und postnatale Gehirnscheibenaufnahmen legen Sie die Dias mit den montierten Gehirnabschnitten, die von Interesse sind, auf einen Mikroskop-Diahalter. Stellen Sie den Schieberegler in das konfokale Mikroskop ein, und wählen Sie den geeigneten Kanal für die im Experiment verwendeten Fluoroforen aus.
Führen Sie Beispielscans durch, um Kartenbilder jedes Gehirnabschnitts mit zwei verschiedenen Wellenlängen für eine allgemeine Ansicht des doppelten Elektroporationsausgangs zu erhalten. Nach der Fertigstellung wählen Sie das 10-fache Objektiv im Multi-Area-Z-Stack-Zeitraffer-Beobachtungsmodus aus. Legen Sie in jedem der ausgewählten XY-Bereiche die entsprechenden Bildperimeter sowie die Tiefe des Scannens entlang der Z-Achse entsprechend den Ebenen der Probe fest, in denen die Fluoreszenz sichtbar ist.
Erhalten Sie Bilder mit geringer Vergrößerung aller ausgewählten Regionen und exportieren Sie die Bilder vom OIF in das TIFF-Format in der Mikroskop-Viewer-Software. Wählen Sie dann die 60-fache Linse aus, und erfassen Sie Bilder mit hoher Vergrößerung, wie gerade gezeigt, um die Zell-zu-Zell-Interaktionen auf einer detaillierteren Ebene zu beobachten. Die zeitliche Lücke zwischen dem doppelten in der Gebärmutterelektroporation Operationen ermöglicht CAG ToresialZellen, die am embryonalen Tag 11.5 an einem seiner Ursprungsorte anvisiert werden, um die Randzone des lateralen Neocortex einschließlich des somatosensorischen Bereichs zu erreichen, rechtzeitig Kontakte mit kortikalen Projektionsneuronen herzustellen, die am embryonalen Tag 13.5 markiert sind.
Die führenden Prozesse der Projektionneuronen, die verbesserte GFP exemiten, erheben sich in der Randzone des Kortex und vermischen sich mit den Prozessen von M-Kirsche-Exzessieren von Katatogiezellen. Bei der Utero-Elektroporation am embryonalen Tag 13.5 erleichtert die Verwendung eines BFP-Exemittplasmas die Kennzeichnung von Projektionsneuronen über verschiedene kortikale Schichten hinweg. Eine zweite Elektroporation in der kontralateralen Seite des embryonalen Tages 15.5 zielt auf die Subpopulation der oberen Schicht der Kalosalprojektionneuronen ab, nicht aber auf die Projektionsneuronen niedriger erlagter Schicht, die sich in früheren Stadien entwickeln.
Die gezielten Neuronen der oberen Schicht dehnen ihre Axone auf die kontralaterale Hemisphäre aus, mit dem charakteristischen Arborisierungsmuster. Eine hohe Vergrößerung ermöglicht eine detailliertere Visualisierung der kalosalen Axoninnervation der gezielten Projektionsneuronen innerhalb der kontralateralen Hemisphäre. Beim Versuch dieses Protokolls ist es wichtig, das Timing der Elektroporation, die zu injizierende Hemisphäre und die Position der Elektroden entsprechend den zielzuschützenden Zellpopulationen zu planen.
Nach diesem Verfahren sind alle Methoden, wie Elektroporation, die interessante. Für beide Zelltypen können mögliche Schaltungsänderungen in vivo untersucht werden. Mit dieser Technik ist es möglich, feine Wechselwirkungen zwischen zwei verschiedenen Zielzellen zu untersuchen.
Einschließlich neuer wissenschaftlicher Informationen in vivo, durch die Elektroporation fluoreszierender synaptischer Proteine.
