我们感谢由NIH国家研究中心（NCRR）资助的卡诺哈布迪炎遗传学中心，感谢其一些线虫菌株。爱泼斯坦H.F.开发的单克隆抗体来自由NICHD主持、由爱荷华大学生物系维护的发展研究杂交瘤库。这项研究得到了以色列科学基金会的赠款（第278/18号赠款）和以色列科技部以及意大利共和国国家促进总局外交和国际合作部的赠款（第3-14337号赠款）的支持。我们感谢本-兹维实验室的成员帮助编写这份手稿。

1. 为 RNAi 准备线虫生长介质板
<ol><li>在 1 L 瓶中，加入 3 克 NaCl、2.5 克巴克托-佩普顿、17 克醋和蒸馏水至 1 L 和高压灭菌液。</li>
	<li>冷瓶至 55 °C。</li>
	<li>加入 25 mL 的 1 M KH2PO4、 pH 6.0、 1 mL 的 1 M CaCl2、 1 mL 的 1 M MgSO4和 1 mL 的胆固醇溶液 （表 1）来制作线虫生长介质 （NGM）。</li>
	<li>加入1 mL的安培素（100毫克/毫升）和0.5兆升的1M IPTG（表1），使NGM-RNAi解决方案。 注:常用的HT115（DE3） 大肠杆菌 含有一种IPTG诱导T7DNA聚合酶，用于表达dsRNA编码质粒。这些质粒还编码的安非他林抵抗。</li>
	<li>通过旋转瓶子混合温液。</li>
	<li>在发动机罩或使用无菌程序时，将 NGM 溶液倒入板中或使用渗透泵，将溶液分配到板中。使用 6 井、12 井、40 毫米或 60 mm 板来此屏幕。阿加应该填补约2/3的板深度。</li>
	<li>让盘子在室温下在长凳上干燥过夜，保持板材覆盖。RNAi 的 NGM 板可在 4 °C 下存储长达一个月。</li>
</ol>2. 种植RNAi细菌和播种板
<ol><li>在发动机罩或使用无菌程序时，将 1 mL 的氨基蛋白（100 毫克/毫升）和 2.5 mL 的四环素（5 毫克/毫升）（表 1）添加到自动封存前的 1 升 LB 溶液中并混合。 注:常用的HT115（DE3） 大肠杆菌 具有四环素耐药性。</li>
	<li>在发动机罩或使用无菌程序时，在 2 mL 深的 96 井无菌板中向每口油井添加 600 μL 的 LB 溶液。最好使用多通道管道来分配媒体。</li>
	<li>使用无菌程序，用HT115（DE3）大肠杆菌为油井接种疫苗，用dsRNA编码质粒转化，以感兴趣的基因或空质粒为控制。盖上盘子，在37°C的夜间孵育。由表达dsRNA的细菌克隆组成的库，相当于预测的C.elegans基因的94%，以前是22、23构建的，并且具有商业性。这里使用的陪护图书馆是由理查德·森本博士实验室26号建造的。</li>
	<li>使用无菌程序，种子75，150或250μL的细菌分别到12井，40毫米和6井或60毫米NGM RNAi板。清楚地标记盘子中目标基因的名称。细菌应覆盖30-50%的黄油表面，不应接触板的边缘。</li>
	<li>允许板在室温下在长凳上干燥至少 2 天，保持板材覆盖。 注:板块可在37°C过夜孵育。使用或存储板之前，请确保内井干燥。出于所有长期目的（即干燥或储存），将板保持在黑暗中。干燥的种子板可在 4 °C 下储存长达一个月。</li>
</ol>3. 胚胎无压力同步
<ol><li>使用蠕虫采摘将大约 100 个鸡蛋从未同步的蠕虫板移到新播种的 NGM 板。</li>
	<li>在 15 °C 下培养动物 5 天，在 20 °C 时培养动物 3.5 天，在 25 °C 下培养动物 2.5 天。 动物应该到产卵的第一天。 注:蠕虫通常在 20 °C 下培养。 然而，不同的伴郎突变菌株可能需要特定的栽培温度。例如，许多对温度敏感的菌株在 15 °C 下培养，但转移到 25 °C 以暴露其表型。</li>
	<li>缓慢地加入1兆L的M9缓冲器（表1），远离细菌草坪。旋转板，使缓冲器完全覆盖板。然后倾斜到一边，从盘子里取出液体，把动物从盘子里洗掉。 注:使用对温度敏感的动物或伴郎突变体时，最好在动物的培养温度下保持协议中使用的缓冲。</li>
	<li>重复步骤 3.3 三次或直到所有的动物被冲下盘子。</li>
	<li>使用标准塑料尖端，从鸡蛋集中的洗净板中切出一平方的醋，并将一块醋放入新播种的 NGM 板上。 注:需要200个鸡蛋才能生产出足够的产卵动物;太多的动物消耗细菌太快。低食物水平会影响蛋白石27。</li>
	<li>在 15 °C 下培养动物 5 天，在 20 °C 时培养 3.5 天，在 25 °C 下培养 2.5 天。 此时，盘子上应该覆盖着同步的鸡蛋。 注:动物可以转移到一个新的板短期更严格的同步。然而，重要的是，只有在产卵的早期阶段使用成人，因为动物可以保留卵子在他们的子宫影响同步。</li>
	<li>慢慢加入1mL的M9缓冲器，远离细菌草坪。</li>
	<li>旋转板，使缓冲器完全覆盖板。然后倾斜到一边，从盘子里取出液体，把动物从盘子里洗掉。</li>
	<li>重复步骤 3.7 三次或直到所有动物被冲出盘子。</li>
	<li>加入1兆L的M9缓冲器，并使用细胞刮刀从盘子中释放鸡蛋。</li>
	<li>从盘子中收集含有鸡蛋的 M9 缓冲器。</li>
	<li>将含有鸡蛋的 M9 缓冲器离心，在 3，000 x g 下 2 分钟。</li>
	<li>拆下超高音量并添加 M9 缓冲器，以达到 1 mL 的体积。</li>
	<li>重新悬念鸡蛋，以破坏任何块的鸡蛋和细菌。</li>
	<li>重复步骤 3.11-3.13 中描述的洗涤过程五次。蛋丸应该呈白色。如果它仍然是黄色/棕色，重复洗涤，直到达到白色颗粒。 注意:留在鸡蛋上的细菌会污染dsRNA表达细菌。</li>
	<li>去除大部分超高超， 留下大约 200 微升。同步鸡蛋可用于 Rnai 屏幕。</li>
</ol>4. 常见表型测定
<ol><li>实验期间动物的培养<ol>
<li>将一滴 +30 鸡蛋放在每个 RNAi 种子板的细菌草坪附近。供参考，也把+30鸡蛋放在盘子里，上面种着含有空载体（L4440）细菌的鸡蛋。</li>
		<li>在 NGM RNAi 种子板上培养年龄同步的动物。实验的持续时间将取决于监测动物的阶段和栽培温度。使用对温度敏感的突变动物时调整培养温度。使用发育迟缓的突变动物时调整培养时间。 注:虽然时间可能有所不同，但一旦动物成年，产卵（以及由此产生的快速食物消费），以及依赖年龄的蛋白体崩溃28，可能会影响结果。因此，建议在产卵开始前给动物打分（成年第1天）。野生动物在 15 °C 下 4.5 天后到达此阶段，在 20 °C 时达到 3 天，在 25 °C 下达到 2 天后达到此阶段。</li>
		<li>重复使用的数量将取决于所检查的基因集的大小。对于伴郎库（97个基因），重复实验至少四次。人口规模取决于所使用的检测。在此讨论的行为分析中，每次重复每次重复的实验情况得分>15。数据和统计分析也在很大程度上取决于使用的检测类型。此处讨论的测定中的数据可以作为 SEM ±表示。</li>
		<li>将RNAi和空载体控制处理动物作为独立种群进行比较。P 值可以使用单向或双向 ANOVA 计算，具体取决于所检查的变化，即单独或两者加重或减轻。在检查单个 RNAi 治疗与控制时，P 值可以使用单向或双向曼-惠特尼排名总和测试进行计算。除统计意义外，根据表型的影响程度考虑命中阈值。</li>
	</ol></li>
	<li>发展逮捕/拖延<ol>
<li>按照第4.1步培养年龄同步动物，直到在含有空载体的控制细菌上生长的动物成年，但在产卵开始前。</li>
		<li>使用立体显微镜监测动物，并计算幼虫和成人的数量，以得分发育迟缓的动物的百分比。供参考，与在空载体控制细菌上生长的突变动物相比。 hsp-1 或 hsp-90 RNAi 治疗导致野生动物发育性逮捕，可用作正控。</li>
		<li>要随着时间的推移，要对发育迟缓的动物进行评分，请重复步骤 4.2.2。 注:如果盘子里有产卵成人，将发育迟缓的动物转移到标有同一靶基因的新NGM-RNAi板上，以避免与后代混淆。</li>
	</ol></li>
	<li>不育或产卵缺陷<ol>
<li>培养年龄同步的动物，就像在第4.1步一样，直到在空病媒控制细菌上生长的动物开始产卵。</li>
		<li>使用立体显微镜监测动物，并给子宫内没有可见卵子的动物打分。供参考，比较在空病媒控制细菌上生长的突变动物。</li>
		<li>或者，使用立体显微镜监测动物，并给子宫内充满卵子的动物打分百分比，定义为EGG铺设缺陷（Egl-d）表型29。</li>
	</ol></li>
	<li>胚胎杀伤力<ol>
<li>培养年龄同步的动物，如第4.1步，直到动物开始产卵。</li>
		<li>将 +100 鸡蛋转移到空盘子中。将鸡蛋排成一排，以简化计数。</li>
		<li>24-48小时后，将盘子中未煮熟的鸡蛋的百分比评分。供参考，与用空病媒控制细菌治疗的动物的卵子进行比较。</li>
	</ol></li>
	<li>麻痹检测<ol>
<li>对于第 1 天成人，按照第 4.1 步培养年龄同步的动物，直到在空病媒控制细菌上生长的动物成年，但在产卵开始前。</li>
		<li>使用精细标记在普通 NGM 阿加板的背面画一条线。</li>
		<li>将 5-10 只动物放在标记线上。</li>
		<li>设置定时器并等待 10 分钟。</li>
		<li>将留在线上的动物的百分比评分为瘫痪蠕虫。供参考，比较在空病媒控制细菌上生长的突变动物。使用 unc-45 RNAi 治疗的野生动物表现出严重的瘫痪表型，可用作正控。 注:此检测突出显示中度至重度瘫痪的动物。这种动物通常直接躺在盘子上，而不是呈现常见的弯曲形状。此外，在瘫痪的蠕虫的头部周围可以看到清除细菌的斑块。</li>
	</ol></li>
	<li>鞭打分析<ol>
<li>按照第4.1步培养年龄同步动物，直到在空病媒控制细菌上生长的动物成年，但在产卵开始前。</li>
		<li>在动物的培养温度下将 100 μL 的 M9 缓冲液输送到 96 井板中。</li>
		<li>将 +15 蠕虫（每口井一只）放入含 M9 缓冲器的井中。</li>
		<li>让动物调整5分钟。</li>
		<li>在立体显微镜下检查每只动物，启动倒计时 15 s 的计时器，并计算每只动物在该时间段内进行的身体弯曲次数。计数的值可以正常化为每分钟身体弯曲。供参考，比较在空病媒控制细菌上生长的突变动物。 注:这种动感检测非常敏感，可以检测出治疗之间的非常轻微的差异。然而，液体中的动能和阿加的动能可能有所不同。</li>
	</ol></li>
</ol>5. 蛋白质击倒的验证
<ol><li>将 250-300 个同步鸡蛋放入 60 mm NGM-RNAi 板上，该板上播种了相关的 dsRNA 表达或空载体（L4440）细菌。 注:RNAi的击倒可能导致胚胎的异常积累，缺乏胚胎或发育性逮捕，这可能会影响基因表达。在确定要检查的动物的年龄时，应考虑这一点。</li>
	<li>对于第 1 天成人，在 15 °C 下培养动物 4.5 天，在 20 °C 时培养动物 3 天，在 25 °C 下养殖 2 天。</li>
	<li>挑选并转移总共 200 只年轻的成年动物到 1.5 mL 管的盖子中，填充 200 μL 的 PBS-T。 注:使用对温度敏感的动物或伴郎突变体时，最好在动物的培养温度下保持协议中使用的缓冲。</li>
	<li>小心地关闭盖子，离心机在 1，000 x g 下 1 分钟。</li>
	<li>加入 800 μL 的 PBS-T （表 1）和离心机在 1，000 x g 1 分钟。</li>
	<li>小心地删除顶部 900 μL。</li>
	<li>重复步骤 5.4-5.6 三次。</li>
	<li>取出 900 μL，留下 100 μL 的溶液，其中包含 200 蠕虫。</li>
	<li>添加 25 μL 的 5 倍样品缓冲器 （表 1）。</li>
	<li>在 92°C 下加热样品 10 分钟，同时在 1000 rpm 时摇晃。然后，样品可以冷冻并保存在 -20 °C 下。</li>
	<li>装载每个样品的 20 μL，并在 SDS-PAGE 凝胶上运行。</li>
	<li>使用适当的抗体进行西式斑点分析，以确定蛋白质的相对稳定性。</li>
	<li>使用密度测量软件（如免费提供的 ImageJ 凝胶模块）确定频段的强度。将所有值标准化到对照样本中测量值。 注:RNAi 在我们的屏幕上被击倒的目的是降低特定伴郎/伴郎的蛋白质水平。因此，评估 RNAi 击倒效率的最佳方法是通过西方污点分析。这需要特定的抗体。或者，qPCR 可用于量化 mRNA 水平。</li>
</ol>

作者没有什么可透露的。

一个反映它是如何组织起来的，并在不同的元子细胞和组织中发挥作用的蛋白石网络的综合图片仍然缺乏。为了解决这一缺陷，需要提供关于该网络各组成部分（如分子伴郎）在发育和老化过程中特定组织中相互作用的具体信息。在这里，我们展示了组织特异性扰动的使用如何使我们能够检查给定组织中的伴郎网络。为了探索组织特异性伴郎遗传相互作用，考虑了三种不同的方法。在第一种方法中，UNC-45，一种在肌肉细胞中高度表达的伴奏，被用来通过喂养RNAi25来筛选伴郎的相互作用。虽然使用专门的伴郎可以辨别组织特异性，但它只能报告它所贡献的高度集中的子网络。请注意，大多数C.elegans神经元对基于喂养的RNAi分娩50具有抗药性，因此使用这种方法来识别神经元细胞中的遗传相互作用需要通过用RNAi增强菌株51检查的突变伴郎。在第二种方法中，一个组织特异性的促进剂被用来驱动肌肉中伴郎的过度表达，从而特别影响肌肉折叠环境40。然而，过度表达单个陪护可能通常有利于折叠环境，从而掩盖由两个陪护者一起造成的中断。第三种方法依靠组织特异性RNAi击倒来检查给定组织41中的伴郎相互作用。这种方法的一个优点是，它允许通过喂养42来瞄准对RNAi分娩有抵抗力的神经元细胞。尽管如此，这种方法仍需要使用轻度突变体（虽然不是专门的），以及这种突变体被交叉到携带组织特异性rde-1救援基因的rde-1突变体中。重要的是，这些方法可以结合，从而有可能调节单个组织甚至单个细胞的伴郎功能。
质量控制机制可以通过扰动蛋白石来影响许多基因产品的功能。这是一个重大的挑战，当使用基因相互作用来探索质量控制网络18。例如，长期表达聚集易发的蛋白质或蛋白石崩溃在老化导致表型恶化的许多无关的可转移蛋白质在C.elegans和酵母45，52，53。此外，哺乳动物细胞中的单体介质内分泌在Hsc70对蛋白质聚合物的功能封存下受到抑制。然而，研究表明，内分泌可以通过Hsc70过度表达来挽救，而聚合不能54，55。同样，在D罗索菲拉的基因屏幕，旨在揭示调节器的热冲击反应，确定了飞行肌肉作用素的误入点突变，构成激活热冲击反应56。综合起来，蛋白石网络的扰动可以暴露可转移的蛋白质或诱发压力，影响结果特异性。尽管如此，分析基因相互作用可以产生高度具体和功能性的洞察力。例如，对内质质视网膜折叠所需的酵母基因的表观分析确定了分子伴郎之间的特定遗传相互作用，随后被验证了19。同样，一个加重的伴郎屏幕，提高两个易聚集模型的毒性（通过动能测量）确定了18个伴郎的特定子集，其中矫形器影响亨廷顿聚合在人体细胞26。在这里，我们展示了蛋白石网络的各种扰动可以揭示特定和功能的伴奏相互作用。
使用RNAi基于喂养的基因相互作用筛选的主要优点是该方法的相对简单性。即使采用一般的行为输出，如活动，也可以揭示新的遗传相互作用（图3）。然而，表达敲击的变异性和部分影响可以限制结果57的稳健性和特异性。此外，基因相互作用并不表示物理相互作用，因此两个基因之间的关系可能是间接的。探索交互的性质和丢弃非特定的交互可以耗时57，58，59。这是一个需要在屏幕设置和验证中解决的问题。例如，在基因筛选中使用空等位基因可以确定这些基因在给定生物过程中是否在相同或不同的通路中发挥作用。然而，使用部分丧失基因功能，低形态等等同位素，如对温度敏感的等位基因，或RNAi依赖的表达向下调节，导致残留活动，可以产生加重或减轻表型，无论基因是在同一通路或平行通路59中起作用。因此，任何相互作用的性质都需要进一步分析。然而，使用低态等位基因和RNAi可以识别广泛的相互作用物，包括基因在同一蛋白质复合物或通路或冗余通路59。虽然这种更大的可能相互作用范围可以在基因屏幕上产生更多的点击率，但它也可能导致非特定的相互作用，例如，在蛋白石崩溃45，53中对温度敏感的等位基因的非特异性暴露。
命中验证和非特定的交互可以通过多种方式进行检查。点击次数应该很低。例如，在 unc-45 突变背景中对伴郎表达的下调节导致一小部分命中（4%），大多数伴郎基因下调节没有显示对动能的任何影响。当DNJ-24M过度表达时，也观察到了类似的速率（6%）。如上所述，一个用于伴郎与易聚集蛋白相互作用的屏幕识别了219个筛选的18个伴郎（8%）。
应使用几个突变等位基因、过度表达线或疾病模型。使用不同的突变等位基因，对伴奏功能有不同的影响，以及不同的遗传背景的菌株，可以支持任何屏幕命中的特异性。或者，使用突变或过度表达不同的伴郎，不会导致类似的扰动可以作为一个负控制。例如，当sti-1、ahsa-1或 daf-41 受到管制时，unc-45（e286）和 unc-45 （m94）都表现出加重行为。此外，当携带ahsa-1（ok3501）删除突变体的动物用hsp-90 RNAi25进行治疗时，也观察到了类似的相互作用。
应检查伴郎命中的身份及其已知的相互作用。例如，在 unc-45 加重屏幕中识别的陪护是 HSP-90 ATPase 周期所需的一组非常具体的陪护，包括编码客户招聘人员 （STI-1）、改造共同陪护者 （AHSA-1） 和客户成熟共同陪护 （DAF-41） 的陪护。事实上，这组共同伴奏形成了一个完整的HSP-90折叠周期60。同样，DNJ-24M屏幕识别HSP-1，Hsp40s40的主要伴郎合作伙伴。
还应检查动物寿命内相互作用的变化。例如，在 unc-45 加重屏幕中发现的伴郎在成年后强烈地影响了活力和肌素组织，但在发育过程中效果较轻。这可能是由于成年后28 年蛋白石网络的变化，也可能是肌素折叠要求在肌纤维折叠和维护之间的变化。
使用互补的生化方法直接检查蛋白质之间的相互作用，以及蛋白质在细胞中的本地化。例如，HSP-90 伴奏，STI-1，AHSA-1 和 DAF-41，被本地化到肉瘤，在那里他们与肌素25互动。
C. 埃莱根斯是监测质量控制的成熟元佐安模型。它通常用于使用细胞生物学、生化和遗传方法的可变工具包来监测细胞和有机蛋白体。在这里，我们采用基因筛选方法和可用的工具57，58，59，如突变库，可用的RNAi图书馆22，23和组织特异性RNAi菌株41，42，监测伴郎在活体动物在发育和衰老过程中的相互作用。使用简单的行为检测，如动感，简化许多可能的基因对的屏幕，以探索新的基因相互作用。然后，这可以作为一个平台，进一步探索伴奏本地化和物理交互使用生化工具，机械地研究他们潜在的相互作用在体内和体外。这里描述的协议已经成功地用于识别新的伴郎互动在C.埃莱甘斯身体壁肌25，40。

细胞通过使用质量控制机器来修复、封存或去除任何受损的蛋白质1，2来应对蛋白质的损害。蛋白质复合物的折叠和组装由分子伴奏支持，这是一组高度保存的蛋白质，可以修复或封存受损的蛋白质3，4，5，6，7。去除受损蛋白质由无处不在的蛋白系统（UPS）8或自噬机械9与伴奏10，11，12合作进行调解。因此，蛋白质平衡（蛋白石）是由折叠和降解机3，13组成的质量控制网络维持的。然而，了解体内蛋白石网络各组成部分之间的相互作用是一项重大挑战。虽然蛋白质-蛋白质相互作用屏幕有助于提供关于物理相互作用和伴郎复合物的重要信息14，15，了解组织特定的伴郎网络在体内的组织和补偿机制是缺乏的。
基因相互作用经常被用作一种强大的工具，用来研究参与共同或补偿性生物通路16、17、18的基因对之间的关系。这种关系可以通过结合一对突变和量化一个基因突变对第二个基因16突变引起的表型严重性的影响来测量。虽然大多数此类组合在表型方面没有表现出任何效果，但某些遗传相互作用可能加剧或减轻所测量表型的严重程度。当双删除突变体的表型比组合单个删除突变体时看到的预期表型更严重时，观察到加重突变，这意味着两个基因在平行通路中工作，共同影响给定函数。相比之下，当双删除突变体的表型不如单个删除突变体中出现的表型严重时，则观察到缓解突变，这意味着两个基因作为一个复合体协同作用或参与同一通路16、18。因此，可以量化的多种表型，包括广泛的表型，如致命性、生长率和育雏大小，以及特定表型（如转录记者）已用于识别遗传相互作用。例如，Jonikas等人依靠ER应激记者使用配对基因删除分析19来检查糖核酸细胞ER展开蛋白反应蛋白体网络的相互作用。
基因相互作用屏幕涉及系统地交叉配对删除突变，以产生一套全面的双突变体20。然而，在动物模型中，特别是在C.elegans中，这种大规模的方法是不可行的。相反，突变菌株可以通过使用RNA干扰（RNAi）21对基因表达进行向下调节来测试其遗传相互作用模式。C. elegans是一个强大的系统，基于 RNAi22，23屏幕。在C.elegans中，双链RNA（dsRNA）的传递是通过细菌喂养实现的，导致dsRNA分子扩散到许多组织。通过这种方式，引入的dsRNA分子通过快速和简单的程序21影响动物。因此，使用RNAi的基因相互作用屏幕可以揭示使用RNAi库24对一组基因或大多数C.elegans编码基因进行下调节的影响。在这样的屏幕上，影响感兴趣的突变体的行为，但不是野生类型菌株的命中是被监测的表型的潜在修饰剂25。在这里，我们应用突变和RNAi筛选的组合，系统地绘制C.elegans组织特异性伴郎相互作用的地图。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well-plates</td>
			<td>SPL</td>
			<td>BA3D16B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mm plates</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>627160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm plates</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>628102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well 2 mL 128.0/85mm</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>780278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>AGA03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>69-52-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BO126-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02382.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td>q30548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0433-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SCGPUO2RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ165FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Frutarom</td>
			<td>2355519000024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>367-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04873.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>001649029100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22189-08-8</td>
			<td>Gift from the Morimoto laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin MHC A (MYO-3) antibody</td>
			<td>Hybridoma Bank</td>
			<td>5-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;7H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>s-0751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>001903029100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>61930705001730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate pouring pump</td>
			<td>Integra</td>
			<td>does it p920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAi Chaperone library</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>0837-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#223;-mercaptoethanol</td>
			<td>Bio world</td>
			<td>41300000-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>64-75-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>002009239100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using caenorhabditis elegans to screen for tissue-specific chaperone interactions

蛋白质和蛋白质复合物的正确折叠和组装对细胞功能至关重要。细胞采用质量控制途径，纠正、封存或消除受损蛋白质，以维持健康的蛋白质组，从而确保细胞蛋白石和防止进一步的蛋白质损伤。由于蛋白酶网络中的多余功能，使用多细胞生物 体Caenorhabdd炎的 伴随编码基因的敲击或突变来筛选可检测表型，在大多数情况下，可检测到小或无表型。我们制定了有针对性的筛选策略，以确定特定功能所需的陪护人员，从而弥合表型和功能之间的差距。具体来说，我们使用RNAi合成交互屏幕监测新的伴郎互动，敲击伴郎表情，一次一个伴郎，在携带伴郎编码基因突变或过度表达兴趣伴郎的动物中。通过破坏两个单独呈现无严重表型的陪护，我们可以识别在两者都扰动时加重或暴露特定表型的陪护。我们证明，这种方法可以识别出特定的伴郎组合，这些伴郎可以协同工作，调节与给定表型相关的蛋白质或蛋白质复合物的折叠。

分别使用 UNC-45 中的温度敏感突变来筛选在允许或限制条件下加重或减轻相互作用的情况 肌肉组装和维护提供了一个有效的系统来研究组织特定的伴郎相互作用。收缩肌肉的功能单元，肉瘤，呈现一个水晶般的结构和调节蛋白排列。运动蛋白肌素的稳定性及其融入收缩肌瘤的厚丝取决于伴郎和UPS组件30的合作。一个例子，这样的陪护是保存和专门肌素伴奏UNC-45，主要表现在身体壁肌31，32，33，34，35。UNC-45的突变已被证明诱导肌素杂乱和严重的动能缺陷在C。埃莱根斯31，36。UNC-45 串联模块组装成一个多站点对接平台37，执行 UNC-45、HSP-90 和 HSP-1 之间的协作，以及肌素灯丝装配25、36、37、38中可能的其他伴奏和伴奏。为了确认已知的UNC-45相互作用，并识别肌肉蛋白石中新的遗传相互作用，我们建立了一个策略，使用C.elegans温度敏感的非c-45突变作为敏感的遗传背景组织特异性伴郎相互作用筛选19，25。
单氨基酸替代在C.elegans UNC-45（L822F和E781K，分别对应e286和m94等位基因:unc-45 （ts） ）当受影响的动物在限制性条件下生长时（>22 °C）时，负责温度依赖性运动缺陷和肌素杂乱现象。相比之下，这些unc-45 （ts）突变体在允许温度 （15 °C）31下没有运动或肌素组织缺陷。在建议的方法中，年龄同步的非c-45（e286）动物在第一幼虫阶段（L1）被RNAi（97个基因）耗尽了不同的分子伴郎，然后在允许的条件下监测到运动缺陷（15°C）（图1）。我们确认了UNC-45和HSP-90蛋白质在基因相互作用屏幕上的已知相互作用，并确认了三个hsp-90共伴，sti-1，ahsa-1和Dahf-41，具体导致合成运动缺陷在unc-45（ts）突变动物，但不是在野生动物25。 我们继续研究，通过监测肌素重链A（MYO-3）的亚细胞排列，使用既定的免疫染色技术39，检测肌素杂乱是由肌素杂乱引起的，是sti-1型、ahsa-1型还是daf-41相关合成表型引起的。虽然用sti-1、ahsa-1或daf-41 RNAi治疗野生动物并不影响肌瘤组织，但非c-45（e286）突变动物中这些基因的耗竭导致肉瘤结构完全中断和MYO-3错位，即使在允许的条件下（15°C）。 这种效果与在限制温度 （25°C）25 下生长的unc-45 （e286）单突变体相媲美。这些结果被证实使用另一个 unc-45（ts）- 等位基因， 即unc-45 （m94）突变动物25.
为了识别破坏 UNC-45 稳定的伴郎，我们接下来根据 RNAi 的基因击倒，筛选出在 25 °C 下改善 了 unc-45 （286） 动物的动感的陪护。虽然 unc-45（e286） 突变动物在 25 °C 下表现出严重的运动缺陷，但使用 RNAi 治疗的动物对编码筛查的 97 个伴郎中的 4 个的基因的移动性显著提高。在这里，结果也被证实使用 unc-45 （m94） 突变动物。因此，使用对温度敏感的突变可以根据屏幕的温度建立加重和缓解屏幕。
使用组织特定的伴郎过度表达来筛选加重相互作用的屏幕 接下来，我们利用单个伴郎的组织特异性过度表达作为肌肉伴郎网络的轻微扰动，用于筛查目的。具体来说，我们利用动物过度表达野生类型dnj-24，编码的C.elegans同源的Hsp40蛋白质DNAJB6在C.elegans身体壁肌（DNJ-24M）。如上所述，L1 DNJ-24M 动物因不同伴郎而使用 RNAi 进行治疗，并监测其运动缺陷（20 °C）（图 1）。虽然DNJ-24M动物没有表现出明显的动能缺陷，但三个基因（在检查的48个伴随编码基因中;6%），即hsp-1、rme-8和dnj-8，特别影响了DNJ-24M表达动物的动感，但不是野生动物。值得注意的是，测试使用动物过度表达不同的伴郎，即HSP-90，在肌肉（HSP90M）的打击特异性，显示没有影响HSP90M运动后，hsp-1，rme-8，或dnj-8 RNAi治疗40。综合起来，筛选平台对伴奏网络采用轻微扰动，如可转移突变蛋白或组织特异性过度表达的表达，导致高度特定的命中率（通常为 +5%）。
使用组织特异性 RNAi 筛查组织特定基因相互作用 组织特异性RNAi敏感菌株允许组织特异性基因的击倒，同时仍然使用细菌喂养进行dsRNA输送。这些菌株是RDE-1阿戈纳特蛋白的突变体，这是RNAi通路中有效基因沉默21所需的主要成分。然而，在组织特异性促进器的控制下表达野生型RDE-1导致有效的组织特异性基因击倒41，42。因此，该工具允许基因相互作用屏幕，而无需使用组织特定的伴奏，如UNC-45或DNAJ-24M。例如，hsp-6（莫塔林）在发育过程中对野生动物的击倒导致强烈的发育逮捕（96±1%的RNAi处理动物）。同时，hsp-6在肌肉中表达野生型RDE-1的菌株中击倒没有引起发育停止，而在肠道细胞中表达野生型RDE-1则导致强发育性阻塞表型（90±3%:在肠道细胞中表达野生型RDE-1，则导致强发育性阻塞表型（90±3%）:图2）。因此，正常发育需要肠道细胞中的HSP-6功能。因此，hsp-6（mg585）的突变会导致轻微的生长延迟，因此，可以通过将突变基因交叉到肠道特异性RNAi菌株中并筛选伴郎RNAE库来筛选加重或减轻伴郎相互作用。
使用基因相互作用监测折叠环境中与年龄相关的变化 动物表现出与年龄相关的活动性下降，这与肉瘤杂乱无章有关43，44，45。蛋白质折叠能力的变化与细胞蛋白石机械28的调节和组成变化相吻合，包括改变的UNC-45、CHN-1和UFD-2水平，肌肉质量控制机械46的蛋白质。根据协议，肌素折叠和降解受到在过渡到成年47的前列腺能力的变化的影响。因此，我们询问这些变化是否会影响陪护互动。例如，我们监测了sti-1、ahsa-1和Dahf-41对活力的影响。 我们发现，虽然sti-1-，ahsa-1 -和daf-41-RNAi处理的动物在幼虫发育期间表现出减少的活力，但在非c-45（ts）成年蠕虫中，活动性明显下降。此外，MYO-3组织在unc-45（ts）突变动物治疗与sti-1，ahsa-1或dah-41 RNAi类似于野生类型蠕虫在第四幼虫阶段（L4），虽然突变体表现出中断的肉瘤后，动物成年（图3）。 相比之下，用空矢量控制处理的非c-45（ts）突变动物和野生类型动物均未受影响（图3）。因此，蛋白石动力学作为年龄或环境条件的函数27，45，46，48，49可以严重影响伴郎相互作用。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61140/61140fig01.jpg"> 图1:使用携带基因突变的 C.elegans 设置RNAi合成相互作用屏幕，编码感兴趣的伴郎。（A） 示意图表示有针对性的伴奏交互屏幕的基本设置。（B） 命中验证需要使用另一个伴郎突变体确认遗传相互作用，以及验证 RNAi 击倒的指定。（C-D）简单的读出，如活动缺陷，可以量化，以确定加重或减轻相互作用，分别使用瘫痪或猛击分析。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61140/61140fig01large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61140/61140fig2v3.jpg"> 图2:线粒体伴奏 hsp-6 的组织特异性RNAAi可用于检查一个组织中的遗传相互作用。野生型肠和肌肉特异性RNAi菌株用 hsp-6 RNAi治疗，（A）发育迟缓得分或（B）图像在成年的第一天拍摄。数据平均± SEM，N=6。比例栏为 1 毫米。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61140/61140fig2v3large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61140/61140fig3v4.jpg"> 图3:RNAi的年龄依赖效应。（A） 随年龄而动感。野生类型或 unc-45 （e286） 胚胎被放置在 sti-1， ahsa-1 或 daf-41 RNAi 种子板在 15 °C， 并得分的动感使用鞭打检测在每个发育阶段， L1-L4， 年轻的成人和成年的第一天.数据是平均± SEM， N=15.（B） 身体壁肌的焦化图像。动物被当作A对待，固定在L4，年轻的成人和成年阶段的第一天，免疫沾染与抗MYO-3抗体。比例栏为 10 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61140/61140fig3v4large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>溶液</td>
			<td>准备说明</td>
			<td>存储</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">1 M CaCl2 （1 L）</td>
			<td>添加 147.01 g CaCl2+2H2O</td>
			<td rowspan="3">存储在 RT</td>
		</tr>
<tr>
<td>将 dH2O 添加到 1 L</td>
		</tr>
<tr>
<td>高压灭菌器或滤光片 （0.22 μm）</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="6">1 M KH2PO4， pH 6.0 （1 L）</td>
			<td>添加 136.09 g KH2PO4
</td>
			<td rowspan="6">存储在 RT</td>
		</tr>
<tr>
<td>添加 800 mL dH2O</td>
		</tr>
<tr>
<td>使用磁搅拌器混合，直到溶解</td>
		</tr>
<tr>
<td>使用 Koh 的提拉特 ph</td>
		</tr>
<tr>
<td>将 dH2O 添加到 1 L</td>
		</tr>
<tr>
<td>高压灭菌器或滤光片 （0.22 μm）</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">1 M MgSO4 （1 L）</td>
			<td>添加 248.58 g MgSO4+7H2O</td>
			<td rowspan="3">存储在 RT</td>
		</tr>
<tr>
<td>将 dH2O 添加到 1 L</td>
		</tr>
<tr>
<td>高压灭菌器或滤光片 （0.22 μm）</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">胆固醇溶液 （50 mL）</td>
			<td>在 50 mL 猎鹰管中加入 250 毫克胆固醇</td>
			<td rowspan="3">存储在 -20 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td>完全溶解在40ml乙醇</td>
		</tr>
<tr>
<td>将乙醇添加到 50 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">1 M IPTG （50 mL）</td>
			<td>在 50 mL 猎鹰管中加入 11.9 克 IPTG（异丙基-β-D-硫高拉托皮拉诺赛德）</td>
			<td rowspan="4">在 -20 °C 的黑暗中存放</td>
		</tr>
<tr>
<td>完全溶解在 40 mL dH2O 中</td>
		</tr>
<tr>
<td>将 dH2O 添加到 50 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>过滤器 （0.22 μm）， 阿利库特 1mL 管</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">安皮西林库存 （50 mL）</td>
			<td>在 50 mL 猎鹰管中加入 5 克安培林</td>
			<td rowspan="4">存储在 -20 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td>完全溶解在 40 mL dH2O 中</td>
		</tr>
<tr>
<td>将 dH2O 添加到 50 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>过滤器 （0.22 μm）， 将 1 mL 阿利库特分发到埃彭多夫管中</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">四环素库存 （50 mL）</td>
			<td>在 50 mL 猎鹰管中加入 250 毫克四环素</td>
			<td rowspan="4">存储在 -20 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td>完全溶解在40ml乙醇</td>
		</tr>
<tr>
<td>将乙醇添加到 50 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>阿利库特 1 mL 管</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="6">M9 缓冲器 （1 L）</td>
			<td>添加 5.8 g Na2HPO4+7H2O</td>
			<td rowspan="6">存储在 RT</td>
		</tr>
<tr>
<td>添加 3 g KH2PO4</td>
		</tr>
<tr>
<td>添加 5 g 纳克</td>
		</tr>
<tr>
<td>添加 0.25 g MgSO4+7H2O</td>
		</tr>
<tr>
<td>将 dH2O 添加到 1 L</td>
		</tr>
<tr>
<td>过滤器 （0.22 μm）</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="8">1X PBS-T （pH 7.4） （1 L）</td>
			<td>添加 8 克纳克</td>
			<td rowspan="8">存储在 RT</td>
		</tr>
<tr>
<td>加入 200 毫克 Kcl</td>
		</tr>
<tr>
<td>添加 1.44 g Na2HPO4+7H2O</td>
		</tr>
<tr>
<td>添加 240 毫克 KH2PO4
</td>
		</tr>
<tr>
<td>完全溶解在 800 mL dH2O 中</td>
		</tr>
<tr>
<td>使用 KOH tp pH 7.4 的提提 pH</td>
		</tr>
<tr>
<td>添加 500 μL 特温-20</td>
		</tr>
<tr>
<td>将 dH2O 添加到 1 L</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="6">5 倍示例缓冲</td>
			<td>添加 6.8 mL dH2O</td>
			<td rowspan="6">存储在 -20 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td>添加 2 mL 0.5M Tris pH 6.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>添加 3.2 mL 甘油</td>
		</tr>
<tr>
<td>添加 1.6 mL 20% SDS</td>
		</tr>
<tr>
<td>添加 0.8 mL + 墨毒醇</td>
		</tr>
<tr>
<td>1% 溴酚蓝色</td>
		</tr>
</tbody></table>表1:解决方案食谱

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Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

为了研究伴奏和伴奏基底相互作用，我们使用RNA干扰与轻度突变或伴郎过度表达相结合，在有机体水平上监测组织特异性蛋白质功能障碍，在 卡诺哈布德炎中 执行合成相互作用屏幕。

使用 卡诺哈布迪炎埃莱甘斯 筛选组织特异性查佩龙相互作用

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

2.8K 次观看.  Ben-Gurion University of the Negev. 为了研究伴奏和伴奏基底相互作用，我们使用RNA干扰与轻度突变或伴郎过度表达相结合，在有机体水平上监测组织特异性蛋白质功能障碍，在 卡诺哈布德炎中 执行合成相互作用屏幕。

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Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

基本的<em&gt;线虫</em&gt;方法:同步和观察

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

科研

生物学

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

使用屏幕在车身尺寸规例中的线虫基因介导的RNA干扰取食策略<em&gt; C.线虫</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

前列腺素的提取与分析<em&gt;线虫</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, and participate in various signaling pathways. Caenorhabditis elegans synthesizes all of the enzymes necessary to produce a range of omega-6 and omega-3 fatty acids. This, combined with the simple anatomy and range of available genetic tools, make it an attractive model to study fatty acid function. In order to investigate the genetic pathways that mediate the physiological effects of dietary fatty acids, we have developed a method to supplement the C. elegans diet with unsaturated fatty acids. Supplementation is an effective means to alter the fatty acid composition of worms and can also be used to rescue defects in fatty acid-deficient mutants. Our method uses nematode growth medium agar (NGM) supplemented with fatty acidsodium salts. The fatty acids in the supplemented plates become incorporated into the membranes of the bacterial food source, which is then taken up by the C. elegans that feed on the supplemented bacteria. We also describe a gas chromatography protocol to monitor the changes in fatty acid composition that occur in supplemented worms. This is an efficient way to supplement the diets of both large and small populations of C. elegans, allowing for a range of applications for this method.

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a useful model to explore the functions of polyunsaturated fatty acids in development and physiology. This protocol describes an efficient method of supplementing the C. elegans diet with polyunsaturated fatty acids.

多不饱和脂肪酸的膳食补充剂<em&gt;秀丽隐杆线虫</em

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, ...

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode&#8217;s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.

可筛选的<em&gt;在体内</em&gt;测定线粒体调节剂使用转基因生物发光<em&gt;秀丽隐杆线虫</em

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These age-associated disorders are characterized by the appearance of protein aggregates with fibrillary structure in the brains of these patients. Exactly why normally soluble proteins undergo an aggregation process remains poorly understood. The discovery that protein aggregation is not limited to disease processes and instead part of the normal aging process enables the study of the molecular and cellular mechanisms that regulate protein aggregation, without using ectopically expressed human disease-associated proteins. Here we describe methodologies to examine inherent protein aggregation in Caenorhabditis elegans through complementary approaches. First, we examine how to grow large numbers of age-synchronized C. elegans to obtain aged animals and we present the biochemical procedures to isolate highly-insoluble-large aggregates. In combination with a targeted genetic knockdown, it is possible to dissect the role of a gene of interest in promoting or preventing age-dependent protein aggregation by using either a comprehensive analysis with quantitative mass spectrometry or a candidate-based analysis with antibodies. These findings are then confirmed by in vivo analysis with transgenic animals expressing fluorescent-tagged aggregation-prone proteins. These methods should help clarify why certain proteins are prone to aggregate with age and ultimately how to keep these proteins fully functional.

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

The goal of the method presented here is to explore protein aggregation during normal aging in the model organism C. elegans. The protocol represents a powerful tool to study the highly insoluble large aggregates that form with age and to determine how changes in proteostasis impact protein aggregation.

方法研究线虫线虫中固有的蛋白质聚集与年龄的变化

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a growing number of age-associated diseases. For instance, proteins with polyglutamine expansions are prone to aggregation, as exemplified with the huntingtin protein and concomitant onset of Huntington&#8217;s disease. The age-associated deterioration of the proteome has been widely studied through the use of transgenic Caenorhabditis elegans expressing polyQ repeats fused to a yellow fluorescent protein (YFP). This polyQ::YFP transgenic animal model facilitates the direct quantification of the age-associated decline of the proteome through imaging the progressive formation of fluorescent foci (i.e., protein aggregates) and subsequent onset of locomotion defects that develop as a result of the collapse of the proteome. Further, the expression of the polyQ::YFP transgene can be driven by tissue-specific promoters, allowing the assessment of proteostasis across tissues in the context of an intact multicellular organism. This model is highly amenable to genetic analysis, thus providing an approach to quantify aging that is complementary to lifespan assays. We describe how to accurately measure polyQ::YFP foci formation within either neurons or body wall muscle during aging, and the subsequent onset of behavioral defects. Next, we highlight how these approaches can be adapted for higher throughput, and potential future applications using other emerging strategies for C. elegans genetic analysis.

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Proteostatic decline is a hallmark of aging, facilitating the onset of neurodegenerative diseases. We outline a protocol to quantifiably measure proteostasis in two different Caenorhabditis elegans tissues through heterologous expression of polyglutamine repeats fused to a fluorescent reporter. This model allows rapid in vivo genetic analysis of proteostasis.

量化秀丽隐杆线虫中组织特异性蛋白静剂下降

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their detrimental effects on the human life quality and the healthcare system, the majority of human neurodegenerative disorders still remain incurable and non-preventable. Therefore, the development of novel therapeutic interventions against such maladies is becoming a pressing urgency. Age-associated deterioration of neuronal circuits and function is evolutionarily conserved in organisms as diverse as the lowly worm Caenorhabditis elegans and humans, signifying similarities in the underlying cellular and molecular mechanisms. C. elegans is a highly malleable genetic model, which offers a well-characterized nervous system, body transparency and a diverse repertoire of genetic and imaging techniques to assess neuronal activity and quality control during ageing. Here, we introduce and describe methodologies utilizing some versatile nematode models, including hyperactivated ion channel-induced necrosis (e.g., deg-3(d) and mec-4(d)) and protein aggregate (e.g., &#945;-syunclein and poly-glutamate)-induced neurotoxicity, to monitor and dissect the cellular and molecular underpinnings of age-related neuronal breakdown. A combination of these animal neurodegeneration models, together with genetic and pharmacological screens for cell death modulators will lead to an unprecedented understanding of age-related breakdown of neuronal function and will provide critical insights with broad relevance to human health and quality of life.

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Here, we introduce and describe widely accessible methodologies utilizing some versatile nematode models, including hyperactivated ion channel-induced necrosis and protein aggregate-induced neurotoxicity, to monitor and dissect the cellular and molecular underpinnings of age-associated neurodegenerative diseases.

建模年龄相关的神经退行性疾病在 卡诺哈布迪蒂斯埃利根

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their ...

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This increased attention has called for the diversification and improvement of animal models capable of reproducing disease phenotypes observed in humans with PCDs. Though murine models have proven invaluable, they are expensive and are associated with laborious, low-throughput methods. Use of the Caenorhabditis elegans nematode model to study PCDs has been justified by its relative ease of maintenance, low cost, and rapid generation time, which allow for high-throughput applications. Additionally, high conservation between the C. elegans and human genomes makes this model an invaluable discovery tool. Nematodes that express fluorescently tagged tissue-specific polyglutamine (polyQ) tracts exhibit age- and polyQ length-dependent aggregation characterized by fluorescent foci. Such reporters are often employed as proxies to monitor changes in proteostasis across tissues. Manual aggregate quantification is time-consuming, limiting experimental throughput. Furthermore, manual foci quantification can introduce bias, as aggregate identification can be highly subjective. Herein, a protocol consisting of worm culturing, image acquisition, and data processing was standardized to support high-throughput aggregate quantification using C. elegans that express intestine-specific polyQ. By implementing a C. elegans-based image processing pipeline using CellProfiler, an image analysis software, this method has been optimized to separate and identify individual worms and enumerate their respective aggregates. Though the concept of automation is not entirely unique, the need to standardize such procedures for reproducibility, elimination of bias from manual counting, and increase throughput is high. It is anticipated that these methods can drastically simplify the screening process of large bacterial, genomic, or drug libraries using the C. elegans model.

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

The following protocol describes the development and optimization of a high-throughput workflow for worm culturing, fluorescence imaging, and automated image processing to quantify polyglutamine aggregates as an assessment of changes in proteostasis.

自动化秀丽隐杆线虫的聚集定量

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...

使用卡诺哈布迪炎埃莱甘斯筛选组织特异性查佩龙相互作用

摘要

探索更多视频

此视频中的章节

基本的

使用屏幕在车身尺寸规例中的线虫基因介导的RNA干扰取食策略

前列腺素的提取与分析

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

多不饱和脂肪酸的膳食补充剂

可筛选的

方法研究线虫线虫中固有的蛋白质聚集与年龄的变化

量化秀丽隐杆线虫中组织特异性蛋白静剂下降

建模年龄相关的神经退行性疾病在卡诺哈布迪蒂斯埃利根

自动化秀丽隐杆线虫的聚集定量

使用 卡诺哈布迪炎埃莱甘斯 筛选组织特异性查佩龙相互作用

摘要

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基本的

使用屏幕在车身尺寸规例中的线虫基因介导的RNA干扰取食策略

前列腺素的提取与分析

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

多不饱和脂肪酸的膳食补充剂

可筛选的

方法研究线虫线虫中固有的蛋白质聚集与年龄的变化

量化秀丽隐杆线虫中组织特异性蛋白静剂下降

建模年龄相关的神经退行性疾病在 卡诺哈布迪蒂斯埃利根

自动化秀丽隐杆线虫的聚集定量

使用卡诺哈布迪炎埃莱甘斯筛选组织特异性查佩龙相互作用

建模年龄相关的神经退行性疾病在卡诺哈布迪蒂斯埃利根