NIH Ulusal Araştırma Kaynakları Merkezi (NCRR) tarafından finanse edilen Caenorhabditis Genetik Merkezi'ne bazı nematod suşları için teşekkür ederiz. H.F. Epstein tarafından geliştirilen monoklonal antikorlar, NICHD himayesinde geliştirilen ve Iowa Üniversitesi Biyoloji Bölümü tarafından sürdürülen Gelişimsel Çalışmalar Hybridoma Bankası'ndan elde edildi. Bu araştırma İsrail Bilim Vakfı'nın (278/18 sayılı hibesi) ve İsrail Bilim ve Teknoloji Bakanlığı ile Dışişleri ve Uluslararası İşbirliği Bakanlığı, Ülke Tanıtım Genel Müdürlüğü, İtalya Cumhuriyeti'nin (3-14337 sayılı hibe) hibesi ile desteklendi. Ben-Zvi laboratuvarı üyelerine bu makalenin hazırlanmasında yardımcı olanlara teşekkür ederiz.

1. RNAi için nematod büyüme medya plakalarının hazırlanması
<ol><li>1 L şişeye 3 g NaCl, 2,5 g Bacto-Peptone, 17 g agar ve 1 L'ye kadar damıtılmış su ekleyin ve otoklavlayın.</li>
	<li>55 °C'ye kadar soğuk şişe.</li>
	<li>Nematod büyüme ortamı (NGM) yapmak için25mL 1 M KH 2 PO4, pH 6.0, 1 mL 1 M CaCl2,1 mL 1 M MgSO4ve 1 mL kolesterol çözeltisi (Tablo 1) ekleyin.</li>
	<li>NGM-RNAi çözeltisi yapmak için 1 mL ampisilin (100 mg/mL) ve 0,5 mL 1 M IPTG(Tablo 1)ekleyin. NOT: Yaygın olarak kullanılan HT115(DE3) E. coli bakterisi, dsRNA kodlayıcı plazmidleri ifade etmek için kullanılan IPTG indükleyici T7 DNA polimeraz içerir. Bu plazmidler ampisilin direnci için de kodlanır.</li>
	<li>Şişeyi döndürerek ılık çözeltiyi karıştırın.</li>
	<li>Kaputta veya steril prosedürler kullanarak, NGM çözeltisini plakalara dökün veya peristaltik bir pompa kullanarak çözeltiyi plakalara dağıtın. Bu ekran için 6 kuyulu, 12 kuyulu, 40 mm veya 60 mm plakalar kullanın. Ağar, plaka derinliğinin yaklaşık 2/3'lerini doldurmalıdır.</li>
	<li>Plakaları kapalı tutarak oda sıcaklığında tezgahta gece boyunca kurutun. RNAi için NGM plakaları bir aya kadar 4 °C'de saklanabilir.</li>
</ol>2. RNAi bakterisi yetiştirmek ve plakaların tohumlarını almak
<ol><li>Davlumbazda veya steril prosedürler kullanarak, önceden otoklavlanmış 1 L LB çözeltisine 1 mL ampisilin (100 mg/mL) ve 2,5 mL tetrasiklin (5 mg/mL)(Tablo 1)ekleyin ve karıştırın. NOT: Yaygın olarak kullanılan HT115(DE3) E. coli bakterileri tetrasikline dirençlidir.</li>
	<li>Davlumbazda veya steril prosedürler kullanarak, 2 mL derinliğinde 96 kuyu steril plakalarda her kuyuya 600 μL LB çözeltisi ekleyin. Medyayı dağıtmak için çok kanallı bir pipet kullanmak en iyisidir.</li>
	<li>Steril prosedürler kullanarak, HT115 (DE3) E. coli bakterisi ile kuyuları aşılayın, bir kontrol olarak ilgi çekici bir geni veya boş bir plazmidi hedef alan dsRNA kodlayıcı bir plazmid ile dönüştürülmüştür. Plakaları örtün ve gece boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın. DsRNA'yı ifade eden bakteri klonlarından oluşan ve tahmin edilen C. elegans genlerinin ~%94'üne karşılık gelen kütüphaneler daha önce22,23 olarak inşa edilmiş ve ticari olarak mevcuttur. Burada kullanılan refakatçi kütüphanesi Dr. Richard Morimoto laboratuvarı 26 tarafından inşaedilmiştir.</li>
	<li>Steril prosedürler kullanılarak, sırasıyla 12 kuyu, 40 mm ve 6-well veya 60 mm NGM RNAi plakalarına 75, 150 veya 250 μL bakteri tohumu. Plakadaki hedef genin adını açıkça işaretle. Bakteriler agar yüzeyinin% 30-50'sini örtmeli ve plakanın kenarlarına dokunmamalıdır.</li>
	<li>Plakaları kapalı tutarak oda sıcaklığında tezgahta en az 2 gün kurumaya bırakın. NOT: Plakalar gece boyunca 37 °C'de inkübe edilebilir. Plakaları kullanmadan veya saklamadan önce iç kuyuların kuru olduğundan emin olun. Tüm uzun vadeli amaçlar için (yani kurutma veya depolama) plakaları karanlıkta tutun. Kurutulmuş, tohumlu plakalar bir aya kadar 4 ° C'de saklanabilir.</li>
</ol>3. Embriyoların stresli olmayan senkronizasyonu
<ol><li>Yaklaşık 100 yumurtayı eşitlenmemiş bir solucan plakasından yeni tohumlanmış bir NGM plakasına taşımak için bir solucan seçimi kullanın.</li>
	<li>Hayvanları 15 °C'de 5 gün, 20 °C'de 3,5 gün veya 25 °C'de 2,5 gün yetiştirin. Hayvanlar yumurtlamanın ilk gününe ulaşmalıdır. NOT: Solucanlar genellikle 20 °C'de yetiştirilir. Bununla birlikte, farklı refakatçi mutant suşları belirli ekim sıcaklıkları gerektirebilir. Örneğin, birçok sıcaklığa duyarlı suş 15 °C'de yetiştirilir, ancak fenotiplerini açığa çıkarmak için 25 °C'ye kaydırılır.</li>
	<li>Bakteri çimlerinden yavaşça ve uzağa 1 mL M9 tamponu (Tablo 1)ekleyin. Plakayı, tampon plakayı tamamen kaplar şekilde döndürün. Sonra bir tarafa eğin ve sıvıyı plakadan çıkarın ve hayvanları plakadan yıkayın. NOT: Sıcaklığa duyarlı hayvanlar veya refakatçi mutantları kullanırken, protokolde kullanılan tamponların hayvanların ekim sıcaklığında tutulması en iyisidir.</li>
	<li>3.3 adımını üç kez veya tüm hayvanlar plakadan yıkanana kadar tekrarlayın.</li>
	<li>Standart bir plastik uç kullanarak, yumurtaların yoğunlaştığı yıkanmış plakadan bir kare agar kesin ve agar parçasını yeni tohumlanmış bir NGM plakasına yerleştirin. NOT: Yeterli yumurtlayan hayvan üretmek için ~200 yumurta gereklidir; çok fazla hayvan bakteriyi çok hızlı tüketir. Düşük gıda seviyeleri proteostaz27etkileyebilir.</li>
	<li>Hayvanları 15 °C'de 5 gün, 20 °C'de 3,5 gün veya 25 °C'de 2,5 gün yetiştirin. Bu noktada tabaklar senkronize yumurta ile kaplanmalıdır. NOT: Hayvanlar daha sıkı bir senkronizasyon için kısa bir süre için yeni bir tabağa kaydırılabilir. Bununla birlikte, hayvanlar uteruslarını etkileyen senkronizasyonda yumurta tutabildiğinden, yetişkinleri sadece yumurtlamanın erken aşamalarında kullanmak önemlidir.</li>
	<li>1 mL M9 tamponu yavaşça ve bakteri çimlerinden uzağa ekleyin.</li>
	<li>Plakayı, tampon plakayı tamamen kaplar şekilde döndürün. Sonra bir tarafa eğin ve sıvıyı plakadan çıkarın ve hayvanları plakadan yıkayın.</li>
	<li>3.7 adımını üç kez veya tüm hayvanlar plakadan yıkanana kadar tekrarlayın.</li>
	<li>1 mL M9 tampon ekleyin ve yumurtaları plakadan serbest bırakmak için bir hücre kazıyıcı kullanın.</li>
	<li>Yumurtaları içeren M9 tamponu plakalardan toplayın.</li>
	<li>Yumurtaları içeren M9 tamponu 2 dakika boyunca 3.000 x g'da santrifüj edin.</li>
	<li>Üst katmanı çıkarın ve 1 mL'lik bir hacme ulaşmak için M9 arabelleği ekleyin.</li>
	<li>Yumurta ve bakteri parçalarını bozmak için yumurtaları yeniden diri açın.</li>
	<li>3.11-3.13 adımlarında açıklanan yıkama prosedürünü beş kez tekrarlayın. Yumurta peleli beyaz görünmelidir. Hala sarı/kahverengiyse, beyaz bir pelet elde edilene kadar yıkamayı tekrarlayın. NOT: Yumurtaların üzerinde kalan bakteriler dsRNA eksprese edici bakterileri kirletebilir.</li>
	<li>Yaklaşık 200 μL bırakarak süpernatantın çoğunu çıkarın, senkronize yumurtalar RNAi ekranlar için kullanılabilir.</li>
</ol>4. Yaygın fenotipik tahliller
<ol><li>Deneyler sırasında hayvanların yetiştirilmesi<ol>
<li>Her RNAi tohumlu tabağa bakteri çimlerine yakın bir damla ~ 30 yumurta yerleştirin. Referans olarak, boş vektör içeren (L4440) bakterilerle tohumlanmış plakalara ~ 30 yumurta yerleştirin.</li>
		<li>NGM RNAi tohumlu tabaklarda yaş senkronize hayvanlar yetiştirin. Deneyin süresi, hayvanların hangi aşamada izleneceğine ve ekim sıcaklığına bağlı olacaktır. Sıcaklığa duyarlı mutant hayvanları kullanırken ekim sıcaklığını ayarlayın. Gelişimsel olarak gecikmiş mutant hayvanları kullanırken ekim süresini ayarlayın. NOT: Zamanlama değişebilirken, hayvanlar yetişkinliğe ulaştığında, yumurtlama (ve ortaya çıkan hızlı gıda tüketimi) ve yaşa bağlı proteostsis çökmesi28, sonuçları etkileyebilir. Bu nedenle, yumurtlama başlamadan önce hayvanları puanlamak önerilir (yetişkinliğin 1. günü). Yabani tip hayvanlar bu aşamaya 15 °C'de 4,5 gün, 20 °C'de 3 gün veya 25 °C'de 2 gün sonra ulaşır.</li>
		<li>Kullanılan tekrar sayısı incelenen gen kümesinin büyüklüğüne bağlı olacaktır. Refakatçi kütüphanesi (97 gen) için deneyleri en az dört kez tekrarlayın. Nüfusun büyüklüğü kullanılan teste bağlıdır. Burada tartışılan davranışsal tahlillerde, her tekrarda deneysel durum başına >15 hayvan puanlayın. Veriler ve istatistiksel analizler de kullanılan tahlil türüne bağlıdır. Burada tartışılan tahlillerdeki veriler SEM ± araç olarak sunulabilir.</li>
		<li>RNAi ve boş vektör kontrolü ile tedavi edilen hayvanları bağımsız popülasyonlar olarak karşılaştırın. P değerleri, incelenen değişikliklere bağlı olarak tek yönlü veya iki yönlü ANOVA kullanılarak hesaplanabilir, yani tek başına veya her ikisini de ağırlaştırabilir veya hafifletebilir. Tek bir RNAi tedavisi ve kontrol incelendiğinde, P değerleri tek yönlü veya iki yönlü Mann-Whitney rütbe toplamı testi kullanılarak hesaplanabilir. İstatistiksel önemin dışında, fenotip üzerindeki etki derecesine göre isabetler için bir eşik düşünün.</li>
	</ol></li>
	<li>Gelişimsel tutuklama/gecikme<ol>
<li>Boş vektör içeren kontrol bakterileri üzerinde yetiştirilen hayvanlar yetişkinliğe ulaşana kadar ancak yumurtlama başlamadan önce 4.1 adımında olduğu gibi yaş senkronize hayvanlar yetiştirin.</li>
		<li>Stereomikroskop kullanarak hayvanları izleyin ve gelişimsel olarak gecikmiş hayvanların yüzdesini puanlamak için larva ve yetişkin sayısını sayın. Referans olarak, boş vektör içeren kontrol bakterileri üzerinde yetişen mutant hayvanlarla karşılaştırın. hsp-1 veya hsp-90 RNAi tedavisi vahşi tip hayvanların gelişimsel olarak tutuklanmasına neden olur ve pozitif kontrol olarak kullanılabilir.</li>
		<li>Zaman içinde gelişimsel olarak geciken hayvanların yüzdesini puanlamak için 4.2.2 adımını tekrarlayın. NOT: Tabakta yumurtlayan yetişkinler varsa, gelişimsel olarak geciken hayvanları, soyla karışıklığı önlemek için aynı hedef gen için etiketlenmiş yeni bir NGM-RNAi plakasına aktarın.</li>
	</ol></li>
	<li>Sterilite veya yumurtlama kusurları<ol>
<li>Boş vektör kontrol bakterileri üzerinde yetişen hayvanlar yumurta bırakmaya başlayana kadar 4.1 adımında olduğu gibi yaş senkronize hayvanlar yetiştirin.</li>
		<li>Stereomikroskop kullanarak hayvanları izleyin ve rahimlerinde görünür yumurta olmayan hayvanların yüzdesini puanla. Referans olarak, boş vektör kontrol bakterilerinde yetişen mutant hayvanlarla karşılaştırın.</li>
		<li>Alternatif olarak, stereomikroskop kullanarak hayvanları izleyin ve EGg Döşeme kusurlu (Egl-d) fenotip29olarak tanımlanan yumurta dolu bir uterusa sahip hayvanların yüzdesini puanlar.</li>
	</ol></li>
	<li>Embriyonik öldürücülük<ol>
<li>Hayvanlar yumurta bırakmaya başlayana kadar 4.1 adımında olduğu gibi yaş senkronize hayvanları yetiştirin.</li>
		<li>~100 yumurtayı boş bir tabağa aktarın. Sayımı basitleştirmek için yumurtaları sıralara yayın.</li>
		<li>24-48 saat sonra tabakta unhatched yumurta yüzde puan. Referans olarak, boş vektör kontrol bakterileri ile tedavi edilen hayvanların yumurtalarıyla karşılaştırın.</li>
	</ol></li>
	<li>Felç tahlil<ol>
<li>1. gün yetişkinler için, boş vektör kontrol bakterileri üzerinde yetişen hayvanlar yetişkinliğe ulaşana kadar ancak yumurtlama başlamadan önce 4.1 adımda olduğu gibi yaş senkronize hayvanlar yetiştirin.</li>
		<li>İnce bir işaretleyici kullanarak normal bir NGM agar plakasının arkasına bir çizgi çizin.</li>
		<li>İşaretli çizgiye 5-10 hayvan yerleştirin.</li>
		<li>Bir zamanlayıcı ayarlayın ve 10 dakika bekleyin.</li>
		<li>Hatta kalan hayvanların yüzdesini felçli solucanlar olarak puanla. Referans olarak, boş vektör kontrol bakterilerinde yetişen mutant hayvanlarla karşılaştırın. Unc-45 RNAi ile tedavi edilen vahşi tip hayvanlar şiddetli felç fenotipi gösterir ve pozitif kontrol olarak kullanılabilir. NOT: Bu test, orta ila şiddetli felç gösteren hayvanları vurgulamaktadır. Bu tür hayvanlar genellikle ortak kavisli şekli sunmak yerine doğrudan plakaya uzanır. Dahası, felçli solucanların kafalarının etrafında bakterilerden temizlenmiş bir yama görülebilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Kırbaçlama tahlilleri<ol>
<li>Boş vektör kontrol bakterileri üzerinde yetişen hayvanlar yetişkinliğe ulaşana kadar ancak yumurtlama başlamadan önce 4.1 adımında olduğu gibi yaş senkronize hayvanları yetiştirin.</li>
		<li>Hayvanların ekim sıcaklığında 100 μL M9 tamponu 96 kuyulu bir plakaya boru.</li>
		<li>M9 tampon içeren kuyulara kuyu başına bir tane olmak üzere ~15 solucan yerleştirin.</li>
		<li>Hayvanların 5 dakika boyunca ayarlanmasına izin verin.</li>
		<li>Stereomikroskop altındaki her hayvanı inceleyin, 15 s'yi geri sayan bir zamanlayıcı başlatın ve her hayvanın bu zaman diliminde gerçekleştirdiği vücut bükümlerinin sayısını sayın. Sayılan değerler, gövde bükümlerine min başına normalleştirilebilir. Referans olarak, boş vektör kontrol bakterilerinde yetişen mutant hayvanlarla karşılaştırın. NOT: Bu hareketlilik tahlili çok hassastır ve tedaviler arasındaki çok hafif farklılıkları tespit edebilir. Bununla birlikte, sıvıdaki hareketlilik ve agar üzerindeki hareketlilik farklılık gösterebilir.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Protein devrilmesinin doğrulanması
<ol><li>250-300 senkronize yumurtayı ilgili dsRNA ifade eden veya boş vektör içeren (L4440) bakterilerle tohumlanmış 60 mm NGM-RNAi plaka üzerine yerleştirin. NOT: RNAi nakavt, embriyoların anormal birikmesine, embriyo eksikliğine veya gen ekspresyonını etkileyebilecek gelişimsel arreste neden olabilir. İncelenecek hayvanların yaşı belirlenirken bu göz önünde bulundurulmalıdır.</li>
	<li>1. gün yetişkinler için, 15 ° C'de 4,5 gün, 20 ° C'de 3 gün veya 25 ° C'de 2 gün hayvan yetiştirin.</li>
	<li>Toplam 200 genç yetişkin hayvanı 200 μL PBS-T ile 1,5 mL tüp dolgusunun kapağına alın ve aktarın. NOT: Sıcaklığa duyarlı hayvanlar veya refakatçi mutantları kullanırken, protokolde kullanılan tamponların hayvanların ekim sıcaklığında tutulması en iyisidir.</li>
	<li>Kapağı dikkatlice kapatın ve 1 dakika boyunca 1.000 x g'da santrifüj edin.</li>
	<li>800 μL PBS-T (Tablo 1) ve santrifüjü 1 dakika boyunca 1.000 x g'da ekleyin.</li>
	<li>Üst 900 μL'yi dikkatlice çıkarın.</li>
	<li>5.4-5.6 arası adımları üç kez yineleyin.</li>
	<li>900 μL'yi çıkarın, 200 solucanı içeren 100 μL çözelti bırakın.</li>
	<li>25 μL 5x numune tamponu ekleyin (Tablo 1).</li>
	<li>1000 rpm'de sallanırken numuneleri 92°C'de 10 dakika ısıtın. Numuneler daha sonra dondurulabilir ve -20 °C'de tutulabilir.</li>
	<li>Her numunenin 20 μL'liğini yükleyin ve bir SDS-PAGE jel üzerinde çalıştırın.</li>
	<li>Proteinin bağıl stabilitesini belirlemek için uygun antikorları kullanarak batı leke analizi yapın.</li>
	<li>Serbestçe kullanılabilen ImageJ jel modülü gibi densitometrik yazılımı kullanarak bantların yoğunluğunu belirleyin. Tüm değerleri denetim örneklerinde ölçülen değerlere normalleştirin. NOT: Ekranlarımızda RNAi nakavtının amacı, belirli bir refakatçinin/yardımcı refakatçinin protein seviyelerini düşürmektir. Bu nedenle, RNAi nakavtının verimliliğini değerlendirmenin en iyi yolu batı leke analizidir. Bu spesifik antikorlar gerektirir. Alternatif olarak, qPCR mRNA düzeylerini ölçmek için kullanılabilir.</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Proteostaz ağının nasıl düzenlendiğini ve farklı metazoan hücre ve dokularda nasıl çalıştığını yansıtan entegre bir resmi eksik kalır. Bu eksikliği gidermek için, gelişim ve yaşlanma sırasında belirli dokularda moleküler refakatçiler gibi bu ağın çeşitli bileşenlerinin etkileşimleri hakkında özel bilgiler gereklidir. Burada, dokuya özgü pertürbasyonların kullanımının belirli bir dokudaki refakatçi ağını incelememizi nasıl sağladığını gösterdik. Dokuya özgü refakatçi ...

Hücreler, hasarlı proteinleri onaran, inzdiye alan veya uzaklaştıran kalite kontrol makineleri kullanarak protein hasarı ile başa çıkar1,2. Protein komplekslerinin katlanır ve montajı moleküler refakatçiler tarafından desteklenir, hasarlı proteinleri onarabilen veya inzal ettirebilen çok korunmuş proteinlerden oluşan çeşitli bir grup 3 ,4,5,6,7. Hasarlı proteinlerin uzaklaştırılması, ubiquitin-proteazom sistemi (UPS)8 veya10, 11, 12refakatçileri ile işbirliği içinde otofaji makineleri9 tarafındanaracılıkedilir. Protein homeostaz (proteostaz) bu nedenle, katlama ve bozulma makinelerinden oluşan kalite kontrol ağları tarafından sürdürülmektedir3,13. Bununla birlikte, proteostaz ağının çeşitli bileşenleri arasındaki etkileşimleri anlamak büyük bir zorluktur. Protein-protein etkileşim ekranları fiziksel etkileşimler ve refakat kompleksleri hakkında önemli bilgilere katkıda bulunurken14,15, organizasyonu anlamak ve dokuya özgü refakatçi ağları içindeki telafi edici mekanizmalar in vivo eksiktir.
Genetik etkileşimler genellikle ortak veya telafi edici biyolojik yollarda yer alan gen çiftleri arasındaki ilişkiyi incelemek için güçlü bir araç olarak kullanılır16,17,18. Bu tür ilişkiler, mutasyon çiftlerinin birleştirilmesi ve bir gendeki bir mutasyonun ikinci gendeki bir mutasyonun neden olduğu fenotipik şiddet üzerindeki etkisinin ölçülmesi ile ölçülebilir16. Bu kombinasyonların çoğu fenotip açısından herhangi bir etki göstermese de, bazı genetik etkileşimler ölçülen fenotipin şiddetini ağırlaştırabilir veya hafifletebilir. Çift silme mutantının fenotipi, tek silme mutantlarının birleştirilmesiyle görülen beklenen fenotipten daha şiddetli olduğunda, iki genin paralel yollarda işlev gördüğünü ve belirli bir işlevi birlikte etkilediğini ima eden ağırlaştırıcı mutasyonlar gözlenir. Buna karşılık, çift silme mutantının fenotipi, tek silme mutantlarında görülen fenotipten daha az şiddetli olduğunda hafifletici mutasyonlar gözlenir, bu da iki genin bir kompleks olarak birlikte hareket ettiğini veya aynı yola katıldığını imaeder 16,18. Buna göre, genetik etkileşimleri tanımlamak için ölümcüllük, büyüme oranları ve kuluçka büyüklüğü gibi geniş fenotipler ve transkripsiyon muhabirleri gibi spesifik fenotipler de dahil olmak üzere ölçülebilen çeşitli fenotipler kullanılmıştır. Örneğin, Jonikas ve arkadaşları, çift yönlü gen silme analizleri kullanarak Saccharomyces cerevisiae ER açılmamış protein yanıtı proteostaz ağının etkileşimlerini incelemek için bir ER stres muhabirine güvendi19.
Genetik etkileşim ekranları, kapsamlı bir çift mutant kümesi oluşturmak için çift yönlü silme mutasyonlarını sistematik olarak geçmeyi içerir20. Bununla birlikte, hayvan modellerinde ve özellikle C. elegans'ta, bu büyük ölçekli yaklaşım mümkün değildir. Bunun yerine, mutant suşları, RNA paraziti (RNAi)21kullanılarak gen ekspresyonunu aşağı düzenleyerek genetik etkileşim kalıpları için test edilebilir. C. elegans RNAi22,23tabanlı ekranlar için güçlü bir sistemdir. C. elegans'ta,çift iplikli RNA (dsRNA) doğumu bakteriyel beslenme ile elde edilir ve dsRNA moleküllerinin çok sayıda dokuya yayılmasına yol açmaktadır. Bu şekilde, tanıtılan dsRNA molekülleri hayvanı hızlı ve basit bir prosedürle etkiler21. Bu nedenle, RNAi kullanan bir genetik etkileşim ekranı, RNAi kütüphanelerini kullanarak genleri kodlayan bir dizi geni veya çoğu C. elegans'ı aşağı düzenlemenin etkisini ortaya getirebilir24. Böyle bir ekranda, ilgi mutantının davranışını etkileyen ancak vahşi tip suşunu etkilemeyen isabetler, izlenen fenotipin potansiyel değiştiricileridir25. Burada, C. elegansdokuya özgü refakatçi etkileşimlerini sistematik olarak haritalamak için mutasyonların ve RNAi taramasının bir kombinasyonunu uyguluyoruz.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well-plates</td>
			<td>SPL</td>
			<td>BA3D16B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mm plates</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>627160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm plates</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>628102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well 2 mL 128.0/85mm</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>780278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>AGA03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>69-52-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BO126-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02382.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td>q30548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0433-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SCGPUO2RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ165FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Frutarom</td>
			<td>2355519000024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>367-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04873.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>001649029100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22189-08-8</td>
			<td>Gift from the Morimoto laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin MHC A (MYO-3) antibody</td>
			<td>Hybridoma Bank</td>
			<td>5-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;7H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>s-0751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>001903029100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>61930705001730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate pouring pump</td>
			<td>Integra</td>
			<td>does it p920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAi Chaperone library</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>0837-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#223;-mercaptoethanol</td>
			<td>Bio world</td>
			<td>41300000-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>64-75-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>002009239100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using caenorhabditis elegans to screen for tissue-specific chaperone interactions

Hücresel fonksiyon için proteinlerin ve protein komplekslerinin doğru katlanır ve montajı esastır. Hücreler, sağlıklı bir proteom sağlamak için hasarlı proteinleri düzelten, inzup tutan veya ortadan kaldıran kalite kontrol yollarını kullanır, böylece hücresel proteostaz sağlar ve daha fazla protein hasarını önler. Proteostaz ağı içindeki gereksiz işlevler nedeniyle, çok hücreli organizma Caenorhabditis elegans'ta refakatçi kodlayıcı genlerde nakavt veya mutasyonlar kullanılarak tespit edilebilir fenotiplerin taranması, çoğu durumda küçük veya hiç fenotip tespit edilmesiyle sonuçlanır. Belirli bir işlev için gerekli olan refakatçileri belirlemek ve böylece fenotip ile işlev arasındaki boşluğu kapatmak için hedefli bir tarama stratejisi geliştirdik. Özellikle, refakatçi kodlayan gende mutasyon taşıyan veya bir ilgi refakatçisini aşırı ifade eden hayvanlarda RNAi sentetik etkileşim ekranlarını, yıkıcı refakatçi ifadesini, her seferinde bir refakatçiyi kullanarak yeni refakatçi etkileşimlerini izliyoruz. Bireysel olarak brüt fenotip sunmayan iki refakatçiyi bozarak, her ikisi de rahatsız edildiğinde belirli bir fenotipi ağırleştiren veya açığa çıkaran refakatçileri tanımlayabiliriz. Bu yaklaşımın, belirli bir fenotiple ilişkili bir protein veya protein komplekslerinin katlamasını modüle etmek için birlikte çalışan belirli refakatçi kümelerini tanımlayabileceğini gösteriyoruz.

UNC-45'te sıcaklığa duyarlı mutasyonların kullanılması, izin verilen veya kısıtlayıcı koşullar altında etkileşimlerin ağırlaştırılması veya hafifletilmesini taramak için Kas montajı ve bakımı, dokuya özgü refakatçi etkileşimlerini incelemek için etkili bir sistem sunar. Kasıt kaslarının fonksiyonel birimi olan sarkom, yapısal ve düzenleyici proteinlerin kristal benzeri bir düzenlemesini sunar. Motor protein miyozinin stabilitesi ve kas kas sarkomlarının kalın fila...

Watch this Scientific Journal Video about Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions at JoVE.com

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Refakatçi-refakatçi ve refakatçi-substrat etkileşimlerini incelemek için, hafif mutasyonlar veya refakatçilerin aşırı ekspresyumu ile birlikte RNA paraziti kullanarak Caenorhabditis elegans'ta sentetik etkileşim ekranları gerçekleştiriyoruz ve dokuya özgü protein disfonksiyonunu organizma düzeyinde izliyoruz.

Dokuya Özgü Chaperone Etkileşimlerini Taramak için Caenorhabditis elegans'ı Kullanma

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...

using-caenorhabditis-elegans-to-screen-for-tissue-specific-chaperone

Research

JoVE Journal

Biology

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

2.8K Görüntüleme.  Ben-Gurion University of the Negev. Refakatçi-refakatçi ve refakatçi-substrat etkileşimlerini incelemek için, hafif mutasyonlar veya refakatçilerin aşırı ekspresyumu ile birlikte RNA paraziti kullanarak Caenorhabditis elegans'ta sentetik etkileşim ekranları gerçekleştiriyoruz ve dokuya özgü protein disfonksiyonunu organizma düzeyinde izliyoruz.

Video: Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Temel<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Yöntem: Senkronizasyon ve Gözlem

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Biyoloji

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

Nematod Vücut büyüklüğü Yönetmelik ilgilendim Genler için Ekran RNA-aracılı Girişim Besleme Strateji Kullanımı<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

Prostaglandin Ekstraksiyon ve Analiz<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, and participate in various signaling pathways. Caenorhabditis elegans synthesizes all of the enzymes necessary to produce a range of omega-6 and omega-3 fatty acids. This, combined with the simple anatomy and range of available genetic tools, make it an attractive model to study fatty acid function. In order to investigate the genetic pathways that mediate the physiological effects of dietary fatty acids, we have developed a method to supplement the C. elegans diet with unsaturated fatty acids. Supplementation is an effective means to alter the fatty acid composition of worms and can also be used to rescue defects in fatty acid-deficient mutants. Our method uses nematode growth medium agar (NGM) supplemented with fatty acidsodium salts. The fatty acids in the supplemented plates become incorporated into the membranes of the bacterial food source, which is then taken up by the C. elegans that feed on the supplemented bacteria. We also describe a gas chromatography protocol to monitor the changes in fatty acid composition that occur in supplemented worms. This is an efficient way to supplement the diets of both large and small populations of C. elegans, allowing for a range of applications for this method.

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a useful model to explore the functions of polyunsaturated fatty acids in development and physiology. This protocol describes an efficient method of supplementing the C. elegans diet with polyunsaturated fatty acids.

Çoklu doymamış yağ asitlerinin Diyet takviyesi<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, ...

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode&#8217;s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.

Bir taranabilir<em&gt; İn Vivo</em&gt; Transjenik biyolojik olarak ışık veren kullanarak Mitokondriyal Modülatörleri için tahlil<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These age-associated disorders are characterized by the appearance of protein aggregates with fibrillary structure in the brains of these patients. Exactly why normally soluble proteins undergo an aggregation process remains poorly understood. The discovery that protein aggregation is not limited to disease processes and instead part of the normal aging process enables the study of the molecular and cellular mechanisms that regulate protein aggregation, without using ectopically expressed human disease-associated proteins. Here we describe methodologies to examine inherent protein aggregation in Caenorhabditis elegans through complementary approaches. First, we examine how to grow large numbers of age-synchronized C. elegans to obtain aged animals and we present the biochemical procedures to isolate highly-insoluble-large aggregates. In combination with a targeted genetic knockdown, it is possible to dissect the role of a gene of interest in promoting or preventing age-dependent protein aggregation by using either a comprehensive analysis with quantitative mass spectrometry or a candidate-based analysis with antibodies. These findings are then confirmed by in vivo analysis with transgenic animals expressing fluorescent-tagged aggregation-prone proteins. These methods should help clarify why certain proteins are prone to aggregate with age and ultimately how to keep these proteins fully functional.

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

The goal of the method presented here is to explore protein aggregation during normal aging in the model organism C. elegans. The protocol represents a powerful tool to study the highly insoluble large aggregates that form with age and to determine how changes in proteostasis impact protein aggregation.

Yöntemleri ile Caenorhabditis elegans çağda doğal Protein toplama çalışma değişikliklere

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a growing number of age-associated diseases. For instance, proteins with polyglutamine expansions are prone to aggregation, as exemplified with the huntingtin protein and concomitant onset of Huntington&#8217;s disease. The age-associated deterioration of the proteome has been widely studied through the use of transgenic Caenorhabditis elegans expressing polyQ repeats fused to a yellow fluorescent protein (YFP). This polyQ::YFP transgenic animal model facilitates the direct quantification of the age-associated decline of the proteome through imaging the progressive formation of fluorescent foci (i.e., protein aggregates) and subsequent onset of locomotion defects that develop as a result of the collapse of the proteome. Further, the expression of the polyQ::YFP transgene can be driven by tissue-specific promoters, allowing the assessment of proteostasis across tissues in the context of an intact multicellular organism. This model is highly amenable to genetic analysis, thus providing an approach to quantify aging that is complementary to lifespan assays. We describe how to accurately measure polyQ::YFP foci formation within either neurons or body wall muscle during aging, and the subsequent onset of behavioral defects. Next, we highlight how these approaches can be adapted for higher throughput, and potential future applications using other emerging strategies for C. elegans genetic analysis.

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Proteostatic decline is a hallmark of aging, facilitating the onset of neurodegenerative diseases. We outline a protocol to quantifiably measure proteostasis in two different Caenorhabditis elegans tissues through heterologous expression of polyglutamine repeats fused to a fluorescent reporter. This model allows rapid in vivo genetic analysis of proteostasis.

Caenorhabditis eleganlarında Dokuya Özgü Proteostatik Düşüşün Ölçülmesi

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their detrimental effects on the human life quality and the healthcare system, the majority of human neurodegenerative disorders still remain incurable and non-preventable. Therefore, the development of novel therapeutic interventions against such maladies is becoming a pressing urgency. Age-associated deterioration of neuronal circuits and function is evolutionarily conserved in organisms as diverse as the lowly worm Caenorhabditis elegans and humans, signifying similarities in the underlying cellular and molecular mechanisms. C. elegans is a highly malleable genetic model, which offers a well-characterized nervous system, body transparency and a diverse repertoire of genetic and imaging techniques to assess neuronal activity and quality control during ageing. Here, we introduce and describe methodologies utilizing some versatile nematode models, including hyperactivated ion channel-induced necrosis (e.g., deg-3(d) and mec-4(d)) and protein aggregate (e.g., &#945;-syunclein and poly-glutamate)-induced neurotoxicity, to monitor and dissect the cellular and molecular underpinnings of age-related neuronal breakdown. A combination of these animal neurodegeneration models, together with genetic and pharmacological screens for cell death modulators will lead to an unprecedented understanding of age-related breakdown of neuronal function and will provide critical insights with broad relevance to human health and quality of life.

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Here, we introduce and describe widely accessible methodologies utilizing some versatile nematode models, including hyperactivated ion channel-induced necrosis and protein aggregate-induced neurotoxicity, to monitor and dissect the cellular and molecular underpinnings of age-associated neurodegenerative diseases.

Caenorhabditis elegans Yaş İlişkili Nörodejeneratif Hastalıkların Modellendirilmesi

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their ...

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This increased attention has called for the diversification and improvement of animal models capable of reproducing disease phenotypes observed in humans with PCDs. Though murine models have proven invaluable, they are expensive and are associated with laborious, low-throughput methods. Use of the Caenorhabditis elegans nematode model to study PCDs has been justified by its relative ease of maintenance, low cost, and rapid generation time, which allow for high-throughput applications. Additionally, high conservation between the C. elegans and human genomes makes this model an invaluable discovery tool. Nematodes that express fluorescently tagged tissue-specific polyglutamine (polyQ) tracts exhibit age- and polyQ length-dependent aggregation characterized by fluorescent foci. Such reporters are often employed as proxies to monitor changes in proteostasis across tissues. Manual aggregate quantification is time-consuming, limiting experimental throughput. Furthermore, manual foci quantification can introduce bias, as aggregate identification can be highly subjective. Herein, a protocol consisting of worm culturing, image acquisition, and data processing was standardized to support high-throughput aggregate quantification using C. elegans that express intestine-specific polyQ. By implementing a C. elegans-based image processing pipeline using CellProfiler, an image analysis software, this method has been optimized to separate and identify individual worms and enumerate their respective aggregates. Though the concept of automation is not entirely unique, the need to standardize such procedures for reproducibility, elimination of bias from manual counting, and increase throughput is high. It is anticipated that these methods can drastically simplify the screening process of large bacterial, genomic, or drug libraries using the C. elegans model.

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

The following protocol describes the development and optimization of a high-throughput workflow for worm culturing, fluorescence imaging, and automated image processing to quantify polyglutamine aggregates as an assessment of changes in proteostasis.

Caenorhabditis elegans'ta Agrega Niceliğinin Otomatikleştirilmesi

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...