私たちは、線虫株の一部のために、NIH国立研究資源センター(NCRR)が資金を提供するカエネルハブディティス遺伝学センターに感謝します。H.F. エプスタインによって開発されたモノクローナル抗体は、NICHDの後援の下で開発され、アイオワ大学生物学部によって維持された開発研究ハイブリドーマ銀行から得られました。本研究は、イスラエル科学財団(278/18)、イスラエル科学技術省、外務省、イタリア共和国国振興総局(助成金第3-14337)からの助成金によって支援されました。この原稿の作成に協力を寄せられるよう、Ben-Zvi研究室のメンバーに感謝します。

1. RNAi用線虫増殖培地プレートの製造
<ol><li>1 Lボトルに、NaClの3g、バクトペプトンの2.5g、寒天17g、蒸留水1Lとオートクレーブを加えます。</li>
	<li>55°Cに冷却ボトル。</li>
	<li>25 mLの1 M KH2PO4、pH6.0、1 M CaCl2の1 mL、1 M MgSO4の1 mL、コレステロール溶液1 mL(表1)を加え、線虫増殖培地(NGM)を作る。</li>
	<li>1 mL のアンピシリン (100 mg/mL) と 0.5 mL の 1 M IPTG (表 1) を加えて NGM-RNAi 溶液を作ります。 注:一般的に使用されるHT115(DE3) 大腸菌 は、dsRNAコードプラスミドを発現するために使用されるIPTG誘導性T7 DNAポリメラーゼを含んでいます。これらのプラスミドはまた、アンピシリン耐性をコードする。</li>
	<li>ボトルを渦巻いて温かい溶液を混ぜます。</li>
	<li>ボンネット内または滅菌手順を使用して、NGM溶液をプレートに注ぐか、蠕動ポンプを使用して、溶液をプレートに分配します。この画面には、6ウェル、12ウェル、40 mmまたは60mmプレートを使用してください。寒天は、プレートの深さの約2/3を埋める必要があります。</li>
	<li>プレートを室温でベンチで一晩乾燥させ、プレートを覆い続けます。RNAi用のNGMプレートは、最大1ヶ月間4°Cで保存することができます。</li>
</ol>2. RNAi菌の増殖とプレートの播種
<ol><li>ボンネットまたは滅菌手順を使用して、LB溶液のオートクレーブ1 Lにアンピシリン(100 mg/mL)1 mLとテトラサイクリン2.5 mL(表1)を加えて混合します。 注:一般的に使用されるHT115(DE3) 大腸菌 はテトラサイクリン耐性です。</li>
	<li>フード内または無菌手順を使用して、2 mL-深さ96ウェル滅菌プレートの各ウェルに600 μLのLB溶液を追加します。メディアを分配するには、マルチチャネル パイプを使用するのが最適です。</li>
	<li>無菌の手順を使用して、HT115(DE3)大腸菌を有する接種ウェルは、対象遺伝子または空のプラスミドを標的とするdsRNAコードプラスミドで形質転換した。プレートを覆い、一晩で37°Cでインキュベートします。dsRNAを発現する細菌クローンからなるライブラリーは、予測されたC.エレガンス遺伝子の約94%に相当し、以前に22、23に構築され、市販されている。ここで使用されるシャペロン図書館は、リチャード・モリモト研究所26によって建設されました。</li>
	<li>滅菌手順を使用して、種子75、150または250μLの細菌をそれぞれ12ウェル、40mmおよび6ウェルまたは60mmNGM RNAiプレートに入れ。プレート上の標的遺伝子の名前を明確にマークする。細菌は寒天表面の30〜50%をカバーする必要があり、プレートの端に触れるべきではありません。</li>
	<li>プレートを室温でベンチで少なくとも2日間乾燥させ、プレートを覆った状態に保ちます。 注:プレートは一晩で37°Cでインキュベートすることができます。プレートを使用または保管する前に、内側の井戸が乾燥していることを確認してください。すべての長期目的(すなわち、乾燥または貯蔵)のために、プレートを暗闇の中に保ちます。乾燥した、種のプレートは、4 °Cで最大1ヶ月間保存することができます。</li>
</ol>3. 胚の非ストレスな同期
<ol><li>ワームピックを使用して、同期していないワームプレートから新しく播種されたNGMプレートに約100個の卵を移動させます。</li>
	<li>動物を15°Cで5日間、20°Cで3.5日、25°Cで2.5日栽培します。 動物は産卵の最初の日に達する必要があります。 注:ワームは一般的に20°Cで栽培されています。 しかし、異なるシャペロン変異株は、特定の栽培温度を必要としてもよい。例えば、多くの温度感受性株は15°Cで栽培されているが、その表現型を露出させるために25°Cにシフトする。</li>
	<li>1 mLのM9バッファー(表1)をゆっくりと加え、細菌の芝生から離します。バッファーがプレートを完全に覆う状態になるように、プレートを回転させます。その後、片側に傾け、プレートから液体を取り除き、プレートから動物を洗い流します。 注:温度感受性動物やシャペロン変異体を使用する場合は、プロトコルで使用されるバッファを動物の栽培温度で維持するのが最善です。</li>
	<li>ステップ3.3を3回、またはすべての動物がプレートから洗い流されるまで繰り返します。</li>
	<li>標準的なプラスチックチップを使用して、卵が濃縮された洗浄プレートから寒天の正方形をカットし、新しく播種されたNGMプレートの上に寒天の部分を置きます。 注:〜200個の卵は十分な産卵動物を生産するために必要とされます。あまりにも多くの動物があまりにも速く細菌を消費します。低い食品レベルは、プロテオスタシス27に影響を与えることができます。</li>
	<li>動物を15°Cで5日間、20°Cで3.5日、または25°Cで2.5日栽培する。 この時点で、プレートは同期卵で覆われるべきです。 注:動物は、より厳格な同期のために、短期間、新しいプレートにシフトすることができます。しかし、動物は子宮内の卵を保持して同期に影響を与えることができるので、産卵の初期段階でのみ成人を使用することが重要です。</li>
	<li>1 mL の M9 バッファーをゆっくりと加え、細菌の芝生から離します。</li>
	<li>バッファーがプレートを完全に覆う状態になるように、プレートを回転させます。その後、片側に傾け、プレートから液体を取り除き、プレートから動物を洗い流します。</li>
	<li>ステップ3.7を3回、またはすべての動物がプレートから洗い流されるまで繰り返します。</li>
	<li>M9バッファーの1 mLを追加し、プレートから卵を解放するためにセルスクレーパーを使用しています。</li>
	<li>プレートから卵を含むM9バッファーを収集します。</li>
	<li>3,000 x g で卵を含むM9緩衝液を2分間遠心分離する。</li>
	<li>上清を取り出し、M9バッファを追加して1mLのボリュームに到達します。</li>
	<li>卵や細菌の塊を混乱させるために卵を再中断します。</li>
	<li>ステップ3.11-3.13に記載の洗浄手順を5回繰り返します。卵ペレットは白く表示されます。黄色/茶色のままの場合は、白いペレットが得られるまで洗浄を繰り返します。 注:卵に残っている細菌は、dsRNA発現細菌を汚染する可能性があります。</li>
	<li>上清の大部分を取り除き、約200 μLを残します。</li>
</ol>4. 一般的な表現法アッセイ
<ol><li>実験中の動物の栽培<ol>
<li>各RNAiシードプレートの細菌の芝生の近くに〜30個の卵を1滴置きます。参考までに、空のベクター含有(L4440)細菌を播種したプレートに30個の卵を置く。</li>
		<li>NGM RNAiシードプレートで年齢同期性動物を栽培します。実験の期間は、動物が監視される段階と栽培の温度に依存します。温度感受性変異動物を使用する場合は、栽培温度を調整します。発達遅滞動物を使用する場合の栽培期間を調整する。 注意:タイミングはさまざまですが、動物が成人に達すると、産卵(および結果として生じる急速な食物消費)、ならびに年齢依存性プロテオスタシス崩壊28が結果に影響を与える可能性があります。したがって、産卵の開始前に動物を採点することをお勧めします (成人の1日目).野生型動物は、15°Cで4.5日後、20°Cで3日または25°Cで2日後にこの段階に達する。</li>
		<li>繰り返しの回数は、調べた遺伝子セットのサイズによって異なります。シャペロンライブラリー(97遺伝子)については、実験を少なくとも4回繰り返す。母集団の大きさは、使用するアッセイによって異なる。ここで説明した行動アッセイでは、各繰り返しにおいて実験条件ごとに>15匹の動物を採点する。データおよび統計分析も、使用するアッセイの種類によっても大きく左右されます。ここで説明するアッセイのデータは、SEM±手段として提示することができる。</li>
		<li>RNAiと空のベクターコントロール処理動物を独立集団と比較します。P値は、一方向または双方向のANOVAを使用して計算することができ、検査された変化、すなわち単独または両方を悪化または緩和する。単一のRNAi治療と対照を調べる場合、P値は一方向または双方向のマン・ホイットニーランク合計検定を使用して計算することができます。統計的有意性以外に、表現型への影響度に基づいてヒットの閾値を考慮する。</li>
	</ol></li>
	<li>発達停止/遅延<ol>
<li>空のベクター含有対照細菌で成長した動物が成人に達するまで、産卵が始まる前に、ステップ4.1のように年齢同期動物を栽培する。</li>
		<li>体型顕微鏡を用いて動物を監視し、幼虫と成人の数を数え、発達遅延動物の割合を計算する。参考として、空のベクター含有対照菌上で増殖した変異動物と比較する。 hsp-1 または hsp-90 RNAi治療は、野生型動物の発達停止をもたらし、陽性対照として使用することができる。</li>
		<li>発達遅延動物の割合を時間の経過とともにスコアするには、ステップ4.2.2を繰り返します。 注:プレート上に産卵成人がいる場合は、子孫との混乱を避けるために、発達遅延動物を同じ標的遺伝子に対して標識された新しいNGM-RNAiプレートに移します。</li>
	</ol></li>
	<li>無菌または産卵不良<ol>
<li>空のベクターコントロール細菌で成長した動物が卵を産み始めるまで、ステップ4.1のように年齢同期性の動物を栽培する。</li>
		<li>実体顕微鏡を使って動物を監視し、子宮に目に見える卵を持たない動物の割合をスコア付けします。参考として、空のベクターコントロール細菌で増殖した変異動物と比較する。</li>
		<li>あるいは、体型顕微鏡を用いて動物を監視し、卵を満載した子宮で動物の割合をスコア付けし、EGg産損物(Egl-d)表現型29と定義する。</li>
	</ol></li>
	<li>胚性致死性<ol>
<li>動物が卵を産み始めるまで、ステップ4.1のように年齢同期性の動物を栽培する。</li>
		<li>空のプレートに〜100個の卵を移します。カウントを簡素化するために行に卵を広げます。</li>
		<li>24-48時間後にプレート上の孵化していない卵の割合をスコア。参考として、空のベクターコントロール細菌で処理された動物の卵と比較する。</li>
	</ol></li>
	<li>麻痺アッセイ<ol>
<li>1日目の成人の場合、空のベクターコントロール細菌で成長した動物が成人期に達するまで、産卵が始まる前に、ステップ4.1のように年齢同期動物を栽培する。</li>
		<li>細かいマーカーを使用して、通常のNGM寒天プレートの背面に線を引きます。</li>
		<li>マークされたラインに5〜10匹の動物を配置します。</li>
		<li>タイマーを設定し、10分待ちます。</li>
		<li>麻痺したワームとしてラインに残っている動物の割合をスコア。参考として、空のベクターコントロール細菌で増殖した変異動物と比較する。 非全45 型RNAiで処理された野生型動物は、重度の麻痺表現型を示し、陽性対照として使用することができる。 注:このアッセイは、中程度から重度の麻痺を示す動物を強調しています。このような動物は、通常、共通の湾曲した形状を提示するのではなく、プレート上にまっすぐに横たわります。さらに、細菌を取り除いたパッチが麻痺したワームの頭部の周りに見える。</li>
	</ol></li>
	<li>スラッシングアッセイ<ol>
<li>空のベクターコントロール細菌で成長した動物が成人に達するまで、卵子の産卵が始まる前に、ステップ4.1のように年齢同期動物を栽培する。</li>
		<li>96ウェルプレートに動物の栽培温度でM9バッファの100 μLをピペット。</li>
		<li>M9バッファー含有ウェルに、ウェルごとに15個のワームを入れます。</li>
		<li>動物は5分間調整しましょう。</li>
		<li>実体顕微鏡下で各動物を調べ、15sをカウントダウンするタイマーを開始し、その期間内に各動物が行う体の曲げ数をカウントする。カウントされた値は、1 分あたりのボディ ベンドに正規化できます。参考として、空のベクターコントロール細菌で増殖した変異動物と比較する。 注:この運動性アッセイは非常に敏感であり、治療間の非常に穏やかな違いを検出することができます。しかし、液体の運動性と寒天の運動性は異なる場合があります。</li>
	</ol></li>
</ol>5. タンパク質ノックダウンの検証
<ol><li>関連するdsRNA発現または空のベクター含有(L4440)細菌を播種した60mmNGM-RNAiプレートに250〜300個の同期卵を置きます。 注:RNAiノックダウンは、胚の不足や遺伝子発現に影響を与える可能性のある発達停止において、胚の異常な蓄積をもたらす可能性があります。これは、検査する動物の年齢を決定する際に考慮されるべきである。</li>
	<li>1日目の成人の場合、15°Cで4.5日間、20°Cで3日間、または25°Cで2日間栽培する。</li>
	<li>200 μL の PBS-T で充填された 1.5 mL チューブのキャップに合計 200 匹の若い成虫動物を選んで移します。 注:温度感受性動物やシャペロン変異体を使用する場合は、プロトコルで使用されるバッファを動物の栽培温度で維持するのが最善です。</li>
	<li>キャップを慎重に閉じ、1,000 x g で遠心分離機を 1 分間閉じます。</li>
	<li>800 μLのPBS-T (表1)と遠心分離機を1,000 x g で1分間加えます。</li>
	<li>上の900 μLを慎重に取り外します。</li>
	<li>手順 5.4 ~ 5.6 を 3 回繰り返します。</li>
	<li>900 μL を取り除き、200 個のワームを含む溶液を 100 μL残します。</li>
	<li>25 μLの 5x サンプルバッファーを追加します (表 1)。</li>
	<li>1000 rpmで振りながら、92°Cで10分間サンプルを加熱します。その後、サンプルを凍結し、-20°Cに保つことができます。</li>
	<li>各サンプルの20 μLをロードし、SDS-PAGEゲルで実行します。</li>
	<li>適切な抗体を用いてウェスタンブロット分析を行い、タンパク質の相対的安定性を決定する。</li>
	<li>自由に利用できる ImageJ ゲル モジュールのような密度のソフトウェアを使用してバンドの強度を決定します。すべての値をコントロールサンプルで測定したものに正規化します。 注:私たちのスクリーンでRNAiノックダウンの目的は、特定のシャペロン/コシャペロンのタンパク質レベルを下げることです。したがって、RNAiノックダウンの効率を評価する最良の方法は、ウェスタンブロット分析によるものである。これには特定の抗体が必要です。代わりに、qPCRを使用してmRNAレベルを定量化することもできます。</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

プロテオスタシスネットワークの統合画像は、それがどのように組織化され、異なるメタゾアン細胞および組織で機能するかを反映しています。この欠点に対処するためには、開発や老化の過程で、分子シャペロンなどのこのネットワークの様々な構成要素の相互作用に関する具体的な情報が必要です。ここでは、組織特異的摂動を使用して、特定の組織におけるシャペロンネットワークを?...

細胞は、損傷したタンパク質1,2を修復、隔離、除去する品質管理機械を採用することで、タンパク質の損傷に対処する。タンパク質複合体の折りたたみおよび組立は、分子シャペロンによって支持され、損傷したタンパク質3、4、5、6、7を修復または隔離することができる高度に保存されたタンパク質の多様なグループである。損傷したタンパク質の除去は、ユビキチンプロテアソーム系(UPS)8またはオートファジー機械9によってシャペロン10、11、12との協調で媒介される。タンパク質ホメオスタシス(プロテオスタシス)は、従って、折りたたみおよび分解機3,13からなる品質管理ネットワークによって維持される。しかし、生体内のプロテオスタシスネットワークの様々な成分間の相互作用を理解することは大きな課題です。タンパク質とタンパク質の相互作用スクリーンは、物理的相互作用とシャペロン複合体14,15に関する重要な情報を提供する一方で、生体内の組織特異的シャペロンネットワーク内の組織および補償機構を理解することは欠けている。
遺伝的相互作用は、一般的なまたは代償的な生物学的経路16、17、18に関与する遺伝子のペア間の関係を調べるための強力なツールとしてしばしば使用される。このような関係は、2番目の遺伝子16の突然変異によって引き起こされる表向きの重症度に対する1つの遺伝子における突然変異の一対を組み合わせることによって測定することができる。そのような組み合わせのほとんどは表現型の面で効果を示さないが、いくつかの遺伝的相互作用は、測定された表現型の重症度を悪化させるか、または緩和することができる。二重欠失変異体の表現型が単一欠失変異体を組み合わせた際に見られる予想より重篤な場合に、悪化する変異が観察され、2つの遺伝子が並列経路で機能し、一緒に特定の機能に影響を与える。これに対し、二重欠失変異体の表現型が単一欠失変異体に見られる表現型よりも重症でない場合に緩和突然変異が観察され、2つの遺伝子が複合体として作用するか、あるいは同じ経路16,18に関与することを示唆する。したがって、致死性、増殖速度およびブロードサイズなどの広範な表現型、ならびに転写レポーターなどの特定の表現型を含む、定量化できる多様な表現型が、遺伝的相互作用を同定するために使用されてきた。例えば、Jonikasらの研究は、ペアワイズ遺伝子欠失解析を用いて、サッカロマイセスCErevisiae ER展開タンパク質応答プロテオスタシスネットワークの相互作用を調べるためにERストレスレポーターに依存していた19。
遺伝的相互作用画面は、二重変異体20の包括的なセットを生成するために体系的にペアワイズ欠失突然変異を交差することを含む。しかし、動物モデル、特にC.エレガンスでは、この大規模なアプローチは実現不可能です。代わりに、変異株は、RNA干渉(RNAi)21を用いて遺伝子発現を下方調節することによって、それらの遺伝的相互作用パターンについて試験することができる。C. エレガンスは RNAi22、23に基づくスクリーンのための強力なシステムです。C.エレガンスでは、二本鎖RNA(dsRNA)の送達は細菌の供給によって達成され、dsRNA分子が多数の組織に広がった。このようにして、導入されたdsRNA分子は、迅速かつ簡単な手順21を介して動物に影響を与える。したがって、RNAiを用いた遺伝的相互作用スクリーンは、RNAiライブラリ24を用いて遺伝子またはほとんどのC.エレガンスコード遺伝子の一組をダウンレギュリングすることの影響を明らかにすることができる。このような画面では、対象の変異体の挙動に影響を与えるが、野生型株は影響しないヒットは、監視されている表現型の潜在的な修飾子である25.ここでは、変異とRNAiスクリーニングの組み合わせを適用して、C.エレガンスにおける組織特異的シャペロン相互作用を体系的にマッピングする。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well-plates</td>
			<td>SPL</td>
			<td>BA3D16B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mm plates</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>627160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm plates</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>628102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well 2 mL 128.0/85mm</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>780278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>AGA03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>69-52-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BO126-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02382.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td>q30548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0433-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SCGPUO2RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ165FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Frutarom</td>
			<td>2355519000024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>367-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04873.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>001649029100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22189-08-8</td>
			<td>Gift from the Morimoto laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin MHC A (MYO-3) antibody</td>
			<td>Hybridoma Bank</td>
			<td>5-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;7H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>s-0751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>001903029100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>61930705001730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate pouring pump</td>
			<td>Integra</td>
			<td>does it p920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAi Chaperone library</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>0837-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#223;-mercaptoethanol</td>
			<td>Bio world</td>
			<td>41300000-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>64-75-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>002009239100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using caenorhabditis elegans to screen for tissue-specific chaperone interactions

細胞機能には、タンパク質およびタンパク質複合体の正しい折り畳みと組み立てが不可欠です。細胞は、損傷したタンパク質を正し、隔離し、または排除する品質管理経路を採用して、健康なプロテオームを維持し、細胞プロテオスタシスを確保し、さらなるタンパク質損傷を防ぎます。プロテオスタシスネットワーク内の冗長な機能のため、多細胞生物 カエノルハブディティス・エレガン スにおけるノックダウンまたはシャペロンコード遺伝子の変異を用いて検出可能な表現型のスクリーニングは、ほとんどの場合、マイナーまたは全く表現型の検出をもたらす。特定の機能に必要なシャペロンを同定し、表現型と機能のギャップを埋める目的でスクリーニング戦略を策定しました。具体的には、RNAi合成相互作用スクリーンを用いた新規シャペロン相互作用、ノックダウンシャペロン発現、一度に1つのシャペロン発現、シャペロンコード遺伝子の変異を運ぶ動物、または目的のシャペロンを過剰発現する動物を監視する。個々にグロス表現型を呈しない2つのシャペロンを破壊することによって、我々は両方が摂動したときに特定の表現型を悪化させるか、または暴露するシャペロンを同定することができる。我々は、このアプローチが、特定の表現型に関連するタンパク質またはタンパク質複合体の折り畳みを調節するために一緒に機能するシャペロンの特定のセットを同定できることを実証する。

UNC-45の温度感受性変異を使用して、許容的または制限的な条件下での相互作用を悪化または緩和するためのスクリーニング 筋肉のアセンブリとメンテナンスは、組織特異的なシャペロン相互作用を研究する効果的なシステムを提供します。収縮性筋肉の機能的単位であるサルコメアは、構造タンパク質と調節タンパク質の結晶状の配置を示す。運動タンパク質ミオシンの安定?...

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Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

シャペロン-シャペロンとシャペロン基質相互作用を研究するために、我々は、軽度の突然変異またはシャペロンの過剰発現と組み合わせてRNA干渉を使用して カエノハブディティス・エレガンス の合成相互作用スクリーンを行い、組織レベルで組織特異的タンパク質機能不全を監視する。

カエノハブディティス・エレガンスを使用して組織特異的シャペロン相互作用をスクリーニングする

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...

using-caenorhabditis-elegans-to-screen-for-tissue-specific-chaperone

Research

JoVE Journal

Biology

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

2.8K ビュー.  Ben-Gurion University of the Negev. シャペロン-シャペロンとシャペロン基質相互作用を研究するために、我々は、軽度の突然変異またはシャペロンの過剰発現と組み合わせてRNA干渉を使用して カエノハブディティス・エレガンス の合成相互作用スクリーンを行い、組織レベルで組織特異的タンパク質機能不全を監視する。

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Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

基本的な<em&gt;線虫Caenorhabditis elegans</em&gt;方法：同期との観測

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

生物学

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

線虫における身体サイズ調節に関与する遺伝子をスクリーニングするための戦略を給餌RNA媒介干渉を用いた<em&gt; Cエレガンス</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, and participate in various signaling pathways. Caenorhabditis elegans synthesizes all of the enzymes necessary to produce a range of omega-6 and omega-3 fatty acids. This, combined with the simple anatomy and range of available genetic tools, make it an attractive model to study fatty acid function. In order to investigate the genetic pathways that mediate the physiological effects of dietary fatty acids, we have developed a method to supplement the C. elegans diet with unsaturated fatty acids. Supplementation is an effective means to alter the fatty acid composition of worms and can also be used to rescue defects in fatty acid-deficient mutants. Our method uses nematode growth medium agar (NGM) supplemented with fatty acidsodium salts. The fatty acids in the supplemented plates become incorporated into the membranes of the bacterial food source, which is then taken up by the C. elegans that feed on the supplemented bacteria. We also describe a gas chromatography protocol to monitor the changes in fatty acid composition that occur in supplemented worms. This is an efficient way to supplement the diets of both large and small populations of C. elegans, allowing for a range of applications for this method.

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a useful model to explore the functions of polyunsaturated fatty acids in development and physiology. This protocol describes an efficient method of supplementing the C. elegans diet with polyunsaturated fatty acids.

多価不飽和脂肪酸の食事補給<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, ...

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode&#8217;s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.

スクリーニング可能<em&gt;インビボ</em&gt;トランスジェニック生物発光を使用したミトコンドリアモジュレーターについてのアッセイ<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These age-associated disorders are characterized by the appearance of protein aggregates with fibrillary structure in the brains of these patients. Exactly why normally soluble proteins undergo an aggregation process remains poorly understood. The discovery that protein aggregation is not limited to disease processes and instead part of the normal aging process enables the study of the molecular and cellular mechanisms that regulate protein aggregation, without using ectopically expressed human disease-associated proteins. Here we describe methodologies to examine inherent protein aggregation in Caenorhabditis elegans through complementary approaches. First, we examine how to grow large numbers of age-synchronized C. elegans to obtain aged animals and we present the biochemical procedures to isolate highly-insoluble-large aggregates. In combination with a targeted genetic knockdown, it is possible to dissect the role of a gene of interest in promoting or preventing age-dependent protein aggregation by using either a comprehensive analysis with quantitative mass spectrometry or a candidate-based analysis with antibodies. These findings are then confirmed by in vivo analysis with transgenic animals expressing fluorescent-tagged aggregation-prone proteins. These methods should help clarify why certain proteins are prone to aggregate with age and ultimately how to keep these proteins fully functional.

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

The goal of the method presented here is to explore protein aggregation during normal aging in the model organism C. elegans. The protocol represents a powerful tool to study the highly insoluble large aggregates that form with age and to determine how changes in proteostasis impact protein aggregation.

線虫の加齢とともに固有の蛋白質の集合の変化を研究するためのメソッド

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a growing number of age-associated diseases. For instance, proteins with polyglutamine expansions are prone to aggregation, as exemplified with the huntingtin protein and concomitant onset of Huntington&#8217;s disease. The age-associated deterioration of the proteome has been widely studied through the use of transgenic Caenorhabditis elegans expressing polyQ repeats fused to a yellow fluorescent protein (YFP). This polyQ::YFP transgenic animal model facilitates the direct quantification of the age-associated decline of the proteome through imaging the progressive formation of fluorescent foci (i.e., protein aggregates) and subsequent onset of locomotion defects that develop as a result of the collapse of the proteome. Further, the expression of the polyQ::YFP transgene can be driven by tissue-specific promoters, allowing the assessment of proteostasis across tissues in the context of an intact multicellular organism. This model is highly amenable to genetic analysis, thus providing an approach to quantify aging that is complementary to lifespan assays. We describe how to accurately measure polyQ::YFP foci formation within either neurons or body wall muscle during aging, and the subsequent onset of behavioral defects. Next, we highlight how these approaches can be adapted for higher throughput, and potential future applications using other emerging strategies for C. elegans genetic analysis.

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Proteostatic decline is a hallmark of aging, facilitating the onset of neurodegenerative diseases. We outline a protocol to quantifiably measure proteostasis in two different Caenorhabditis elegans tissues through heterologous expression of polyglutamine repeats fused to a fluorescent reporter. This model allows rapid in vivo genetic analysis of proteostasis.

カエノハブディティス・エレガンスにおける組織特異的プロテオスタティック低下の定量化

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their detrimental effects on the human life quality and the healthcare system, the majority of human neurodegenerative disorders still remain incurable and non-preventable. Therefore, the development of novel therapeutic interventions against such maladies is becoming a pressing urgency. Age-associated deterioration of neuronal circuits and function is evolutionarily conserved in organisms as diverse as the lowly worm Caenorhabditis elegans and humans, signifying similarities in the underlying cellular and molecular mechanisms. C. elegans is a highly malleable genetic model, which offers a well-characterized nervous system, body transparency and a diverse repertoire of genetic and imaging techniques to assess neuronal activity and quality control during ageing. Here, we introduce and describe methodologies utilizing some versatile nematode models, including hyperactivated ion channel-induced necrosis (e.g., deg-3(d) and mec-4(d)) and protein aggregate (e.g., &#945;-syunclein and poly-glutamate)-induced neurotoxicity, to monitor and dissect the cellular and molecular underpinnings of age-related neuronal breakdown. A combination of these animal neurodegeneration models, together with genetic and pharmacological screens for cell death modulators will lead to an unprecedented understanding of age-related breakdown of neuronal function and will provide critical insights with broad relevance to human health and quality of life.

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Here, we introduce and describe widely accessible methodologies utilizing some versatile nematode models, including hyperactivated ion channel-induced necrosis and protein aggregate-induced neurotoxicity, to monitor and dissect the cellular and molecular underpinnings of age-associated neurodegenerative diseases.

カエノハブディティス・エレガンスにおける年齢関連神経変性疾患のモデル化

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their ...

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

The nematode Caenorhabditis elegans is a model system for host-microbe and host-microbiome interactions. Many studies to date use batch digests rather than individual worm samples to quantify bacterial load in this organism. Here it is argued that the large inter-individual variability seen in bacterial colonization of the C. elegans intestine is informative, and that batch digest methods discard information that is important for accurate comparison across conditions. As describing the variation inherent to these samples requires large numbers of individuals, a convenient 96-well plate protocol for disruption and colony plating of individual worms is established.

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

This protocol describes a 96-well disruption of individual bacterially colonized Caenorhabditis elegans following cold paralysis and surface bleaching&#160;to remove external bacteria. The resulting suspension is plated on agar plates to allow accurate, medium-throughput quantification of bacterial load in large numbers of individual worms.

単一ワームデータを使用して 、Caenorhabditisエレガンス-細菌相互作用における不均一性を定量化

The nematode Caenorhabditis elegans is a model system for host-microbe and host-microbiome interactions. Many studies to date use batch digests rather ...

C. elegansおよび肝臓がん細胞株におけるマイトファジーの定量化

Detection of Mitophagy in Caenorhabditis elegans and Mammalian Cells Using Organelle-Specific Dyes

Mitochondria are essential for various biological functions, including energy production, lipid metabolism, calcium homeostasis, heme biosynthesis, regulated cell death, and the generation of reactive oxygen species (ROS). ROS are vital for key biological processes. However, when uncontrolled, they can lead to oxidative injury, including mitochondrial damage. Damaged mitochondria release more ROS, thereby intensifying cellular injury and the disease state. A homeostatic process named mitochondrial autophagy (mitophagy) selectively removes damaged mitochondria, which are then replaced by new ones. There are multiple mitophagy pathways, with the common endpoint being the breakdown of the damaged mitochondria in lysosomes. 
Several methodologies, including genetic sensors, antibody immunofluorescence, and electron microscopy, use this endpoint to quantify mitophagy. Each method for examining mitophagy has its advantages, such as specific tissue/cell targeting (with genetic sensors) and great detail (with electron microscopy). However, these methods often require expensive resources, trained personnel, and a lengthy preparation time before the actual experiment, such as for creating transgenic animals. Here, we present a cost-effective alternative for measuring mitophagy using commercially available fluorescent dyes targeting mitochondria and lysosomes. This method effectively measures mitophagy in the nematode Caenorhabditis elegans and human liver cells, which indicates its potential efficiency in other model systems.

著者スポットライト:オルガネラ特異的色素を用いた線虫および哺乳類細胞におけるマイトファジーの検出  

Exploring mitophagy through electron microscopy, genetic sensors, and immunofluorescence requires costly equipment, skilled personnel, and a significant time investment. Here, we demonstrate the efficacy of a commercial fluorescence dye kit in quantifying the mitophagy process in both Caenorhabditis elegans and a liver cancer cell line.

オルガネラ特異的色素を用いた カエノラブディティス・エレガンス および哺乳類細胞におけるマイトファジーの検出

Mitochondria are essential for various biological functions, including energy production, lipid metabolism, calcium homeostasis, heme biosynthesis, ...