Agradecemos ao Centro de Genética de Caenorhabditis, financiado pelo Nih National Center for Research Resources (NCRR), por algumas das cepas de nematoides. Anticorpos monoclonais desenvolvidos por H.F. Epstein foram obtidos do Banco hybridoma de estudos de desenvolvimento desenvolvido sob os auspícios do NICHD e mantido pelo Departamento de Biologia da Universidade de Iowa. Esta pesquisa foi apoiada por uma bolsa da Fundação de Ciência de Israel (bolsa nº 278/18) e por uma bolsa do Ministério da Ciência & Tecnologia de Israel, e do Ministério das Relações Exteriores e Cooperação Internacional, Direção Geral de Promoção de Países, República Italiana (bolsa nº 3-14337). Agradecemos aos membros do laboratório Ben-Zvi pela ajuda na preparação deste manuscrito.

1. Preparação de placas de mídia de crescimento de nematoide para RNAi
<ol><li>A uma garrafa de 1 L, adicione 3 g de NaCl, 2,5 g de Bacto-Peptone, 17 g de ágar e água destilada até 1 L e autoclave.</li>
	<li>Frie a 55 °C.</li>
	<li>Adicione 25 mL de 1 M KH2PO4, pH 6.0, 1 mL de 1 M CaCl2, 1 mL de 1 M MgSO4e 1 mL de solução decolesterol (Tabela 1) para fazer mídia de crescimento nematode (NGM).</li>
	<li>Adicione 1 mL de ampicilina (100 mg/mL) e 0,5 mL de 1 M IPTG(Tabela 1) para fazer a solução NGM-RNAi. NOTA: As bactérias HT115(DE3) E. coli comumente utilizadas contêm uma polimerase de DNA T7 indutível pelo IPTG usada para expressar os plasmídeos codificadores de dsRNA. Estes plasmídeos também codificam para resistência à ampicilina.</li>
	<li>Misture a solução quente girando a garrafa.</li>
	<li>No capô ou usando procedimentos estéreis, despeje a solução NGM em placas ou usando uma bomba peristáltica, dispense a solução em placas. Use placas de 6 poços, 12, 40 mm ou 60 mm para esta tela. O ágar deve encher cerca de 2/3 da profundidade da placa.</li>
	<li>Deixe as placas secarem durante a noite no banco em temperatura ambiente, mantendo as placas cobertas. As placas de NGM para RNAi podem ser armazenadas a 4 °C por até um mês.</li>
</ol>2. Cultivar bactérias RNAi e semear as placas
<ol><li>No capô ou utilizando procedimentos estéreis, adicione 1 mL de ampicillina (100 mg/mL) e 2,5 mL de tetraciclina (5 mg/mL)(Tabela 1) a uma solução e mistura pré-autoclaved 1 L de LB. NOTA: As bactérias HT115(DE3) E. coli são resistentes à tetraciclina.</li>
	<li>No capô ou usando procedimentos estéreis, adicione 600 μL de solução LB a cada poço em placas estéreis de 2 mL de profundidade. É melhor usar um pipet multicanal para dispensar a mídia.</li>
	<li>Usando procedimentos estéreis, inoculam poços com bactérias HT115(DE3) E. coli transformadas com um plasmídeo codificador de dsRNA visando um gene de interesse ou um plasmídeo vazio, como controle. Cubra as placas e incubar a 37 °C durante a noite. Bibliotecas que consistem em clones bacterianos expressando dsRNA, correspondendo a ~94% dos genes C. elegans previstos foram previamente construídos22,23 e estão comercialmente disponíveis. A biblioteca de acompanhantes utilizada aqui foi construída pelo Laboratório Dr. Richard Morimoto26.</li>
	<li>Utilizando procedimentos estéreis, sementes 75, 150 ou 250 μL de bactérias nas placas de 12 poços, 40 mm e 6-well ou 60 mm NGM RNAi, respectivamente. Marque claramente o nome do gene alvo na placa. As bactérias devem cobrir 30-50% da superfície do ágar e não devem tocar nas bordas da placa.</li>
	<li>Deixe as placas secarem por pelo menos 2 dias no banco à temperatura ambiente, mantendo as placas cobertas. NOTA: As placas podem ser incubadas a 37 °C durante a noite. Certifique-se de que os poços internos estão secos antes de usar ou armazenar as placas. Para todos os fins de longo prazo (ou seja, secagem ou armazenamento) mantenha as placas no escuro. As placas secas e semeadas podem ser armazenadas a 4 °C por até um mês.</li>
</ol>3. Sincronização não estressante de embriões
<ol><li>Use uma picareta de vermes para mover cerca de 100 ovos de uma placa de vermes não sincronizada para uma placa de NGM recém-semeada.</li>
	<li>Cultivar animais por 5 dias a 15 °C, 3,5 dias a 20 °C ou 2,5 dias a 25 °C. Os animais devem chegar ao primeiro dia de colocação de ovos. NOTA: Os vermes são comumente cultivados a 20 °C. No entanto, diferentes cepas mutantes de acompanhantes podem exigir temperaturas específicas de cultivo. Por exemplo, muitas cepas sensíveis à temperatura são cultivadas a 15 °C, mas deslocadas para 25 °C para expor seu fenótipo.</li>
	<li>Adicione 1 mL de tampão M9(Tabela 1)lentamente e longe do gramado bacteriano. Gire a placa para que o tampão cubra completamente a placa. Em seguida, incline-o para um lado e remova o líquido da placa e lave os animais da placa. NOTA: Ao usar animais sensíveis à temperatura ou a acompanhante de mutantes, é melhor manter os tampões usados no protocolo na temperatura de cultivo dos animais.</li>
	<li>Repita o passo 3.3 três vezes ou até que todos os animais sejam lavados fora da placa.</li>
	<li>Usando uma ponta de plástico padrão, corte um quadrado de ágar da placa lavada onde os ovos estão concentrados e coloque o pedaço de ágar em uma placa de NGM recém-semeada. NOTA: ~200 ovos são necessários para produzir animais suficientes que pomentem ovos; muitos animais consomem as bactérias muito rapidamente. Baixos níveis de alimentos podem impactar a proteostase27.</li>
	<li>Cultive os animais por 5 dias a 15 °C, 3,5 dias a 20 °C ou 2,5 dias a 25 °C. Neste ponto, as placas devem ser cobertas com ovos sincronizados. NOTA: Os animais podem ser deslocados para uma nova placa por uma curta duração para uma sincronização mais rigorosa. No entanto, é importante usar apenas adultos nos estágios iniciais da colocação de ovos, pois os animais podem reter ovos em seu útero impactando a sincronização.</li>
	<li>Adicione 1 mL de tampão M9 lentamente e longe do gramado bacteriano.</li>
	<li>Gire a placa para que o tampão cubra completamente a placa. Em seguida, incline-o para um lado e remova o líquido da placa e lave os animais da placa.</li>
	<li>Repita o passo 3,7 três vezes ou até que todos os animais sejam lavados fora da placa.</li>
	<li>Adicione 1 mL de tampão M9 e use um raspador de células para liberar os ovos da placa.</li>
	<li>Colete o tampão M9 contendo os ovos das placas.</li>
	<li>Centrifugar o tampão M9 contendo os ovos a 3.000 x g por 2 min.</li>
	<li>Remova o supernatante e adicione o tampão M9 para atingir um volume de 1 mL.</li>
	<li>Resuspenda os ovos para interromper quaisquer pedaços de ovos e bactérias.</li>
	<li>Repita o procedimento de lavagem descrito nas etapas 3.11-3.13 cinco vezes. A pelota de ovo deve parecer branca. Se ainda estiver amarelo/marrom, repita a lavagem até que uma pelota branca seja atingida. NOTA: Bactérias que permanecem nos ovos podem contaminar as bactérias que expressam dsRNA.</li>
	<li>Remova a maior parte do supernatante, deixando cerca de 200 μL. Ovos sincronizados podem ser usados para telas RNAi.</li>
</ol>4. Ensaios fenotípicos comuns
<ol><li>Cultivo de animais durante experimentos<ol>
<li>Coloque uma gota de ~30 ovos perto do gramado bacteriano em cada prato semeado rnai. Para referência, coloque também ~30 ovos em placas semeadas com bactérias contendo vetores vazios (L4440).</li>
		<li>Cultivar animais sincronizados com a idade em placas semeadas por NGM RNAi. A duração do experimento dependerá do estágio em que os animais devem ser monitorados e da temperatura do cultivo. Ajuste a temperatura do cultivo ao usar animais mutantes sensíveis à temperatura. Ajuste a duração do cultivo ao usar animais mutantes atrasados em desenvolvimento. NOTA: Embora o tempo possa variar, uma vez que os animais atingem a idade adulta, a colocação de ovos (e o consequente consumo rápido de alimentos), bem como o colapso da proteose dependente da idade28,podem impactar os resultados. Recomenda-se, portanto, pontuar animais antes do início da colocação de ovos (dia 1 da idade adulta). Animais do tipo selvagem chegam a esta fase após 4,5 dias a 15 °C, 3 dias a 20 °C ou 2 dias a 25 °C.</li>
		<li>O número de repetições utilizadas dependerá do tamanho do conjunto genético examinado. Para a biblioteca de acompanhantes (97 genes), repita experimentos pelo menos quatro vezes. O tamanho da população depende do ensaio utilizado. Nos ensaios comportamentais aqui discutidos, escore >15 animais por condição experimental em cada repetição. Os dados e análises estatísticas também dependem fortemente do tipo de ensaio utilizado. Os dados nos ensaios aqui discutidos podem ser apresentados como meios ± SEM.</li>
		<li>Compare os animais tratados com controle de vetores RNAi e vazios como populações independentes. Os valores P podem ser calculados utilizando-se ANOVA unidirecional ou bidirecional, dependendo das alterações examinadas, ou seja, agravando ou aliviando sozinho ou ambos. Ao examinar um único tratamento RNAi versus controle, os valores P podem ser calculados usando um teste de soma de classificação mann-whitney de uma forma ou de duas vias. Além da significância estatística, considere um limiar para acertos com base no grau de impacto no fenótipo.</li>
	</ol></li>
	<li>Prisão/atraso do desenvolvimento<ol>
<li>Cultivar animais sincronizados pela idade como na etapa 4.1 até que os animais cultivados em bactérias de controle contendo vetores vazios cheguem à idade adulta, mas antes do início da colocação dos ovos.</li>
		<li>Monitore animais usando um estereótipo e conte o número de larvas e adultos para pontuar a porcentagem de animais atrasados no desenvolvimento. Para referência, compare-se aos animais mutantes cultivados em bactérias de controle contendo vetores vazios. hsp-1 ou hsp-90 RNAi tratamento resulta em detenção de desenvolvimento de animais do tipo selvagem e pode ser usado como um controle positivo.</li>
		<li>Para pontuar o percentual de animais atrasados ao longo do tempo, repita a etapa 4.2.2. NOTA: Se houver adultos que poem ovos na placa, transfira os animais atrasados em desenvolvimento para uma nova placa NGM-RNAi rotulada para o mesmo gene alvo para evitar confusão com prole.</li>
	</ol></li>
	<li>Defeitos de esterilidade ou de colocação de ovos<ol>
<li>Cultivar animais sincronizados com a idade como na etapa 4.1 até que animais cultivados em bactérias vazias de controle de vetores comecem a colocar ovos.</li>
		<li>Monitore os animais usando um estereómico e marque a porcentagem de animais sem ovos visíveis em seu útero. Para referência, compare-se aos animais mutantes cultivados em bactérias vazias de controle de vetores.</li>
		<li>Alternativamente, monitore os animais usando um estereómico e marque a porcentagem de animais com útero cheio de ovos, definido como fenótipo defeituoso de EGg (Egl-d)29.</li>
	</ol></li>
	<li>Letalidade embrionária<ol>
<li>Cultivar animais sincronizados com a idade como na etapa 4.1 até que os animais comecem a colocar ovos.</li>
		<li>Transfira ~100 ovos para um prato vazio. Espalhe os ovos em fileiras para simplificar a contagem.</li>
		<li>Marque a porcentagem de ovos não esquecidos na placa após 24-48 horas. Para referência, compare-se aos ovos de animais tratados com bactérias vazias de controle de vetores.</li>
	</ol></li>
	<li>Ensaio de paralisia<ol>
<li>Para adultos do primeiro dia, cultivar animais sincronizados com a idade como na etapa 4.1 até que os animais cultivados em bactérias vazias de controle de vetores cheguem à idade adulta, mas antes do início da colocação dos ovos.</li>
		<li>Desenhe uma linha na parte de trás de uma placa de ágar NGM regular usando um marcador fino.</li>
		<li>Coloque 5-10 animais na linha marcada.</li>
		<li>Estabeleça um temporizador e espere por 10 minutos.</li>
		<li>Marque a porcentagem de animais que permanecem na linha como vermes paralisados. Para referência, compare-se aos animais mutantes cultivados em bactérias vazias de controle de vetores. Animais do tipo selvagem tratados com unc-45 RNAi apresentam fenótipo de paralisia grave e podem ser usados como controle positivo. NOTA: Este ensaio destaca animais com paralisia média a grave. Esses animais geralmente ficam retos na placa, em vez de apresentar a forma curva comum. Além disso, um remendo limpo de bactérias é visível ao redor das cabeças de vermes paralisados.</li>
	</ol></li>
	<li>Ensaio de espancamento<ol>
<li>Cultivar animais sincronizados pela idade como na etapa 4.1 até que os animais cultivados em bactérias vazias de controle de vetores cheguem à idade adulta, mas antes do início da colocação de ovos.</li>
		<li>Pipet 100 μL de tampão M9 na temperatura de cultivo dos animais em uma placa de 96 poços.</li>
		<li>Coloque ~15 worms, um por poço, nos poços contendo tampão M9.</li>
		<li>Deixe os animais se ajustarem por 5 minutos.</li>
		<li>Examine cada animal sob o estereótipo, inicie um temporizador contando 15 s, e conte o número de curvas corporais que cada animal realiza nesse período de tempo. Os valores contados podem ser normalizados para dobras corporais por minuto. Para referência, compare-se aos animais mutantes cultivados em bactérias vazias de controle de vetores. NOTA: Este ensaio de motilidade é muito sensível e pode detectar diferenças muito leves entre os tratamentos. No entanto, a motilidade em líquido e motilidade no ágar pode diferir.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Validação do knockdown de proteínas
<ol><li>Coloque 250-300 ovos sincronizados em uma placa NGM-RNAi de 60 mm semeada com as bactérias relevantes que expressam dsRNA ou esvaziam as bactérias contendo vetores (L4440). NOTA: O knockdown rnai pode resultar em acúmulo aberrante de embriões, na falta de embriões ou em prisão de desenvolvimento que poderia impactar a expressão genética. Isso deve ser considerado ao determinar a idade dos animais a serem examinados.</li>
	<li>Para o dia 1 adultos, cultivar animais por 4,5 dias a 15 °C, 3 dias a 20 °C ou 2 dias a 25 °C.</li>
	<li>Escolha e transfira um total de 200 animais adultos jovens para a tampa de um tubo de 1,5 mL com 200 μL de PBS-T. NOTA: Ao usar animais sensíveis à temperatura ou a acompanhante de mutantes, é melhor manter os tampões usados no protocolo na temperatura de cultivo dos animais.</li>
	<li>Feche a tampa cuidadosamente e centrífuga a 1.000 x g por 1 min.</li>
	<li>Adicione 800 μL de PBS-T (Tabela 1) e centrífuga a 1.000 x g por 1 min.</li>
	<li>Remova cuidadosamente a parte superior de 900 μL.</li>
	<li>Repita as etapas 5.4-5.6 três vezes.</li>
	<li>Remova 900 μL, deixando 100 μL de solução contendo os 200 worms.</li>
	<li>Adicione 25 μL de tampão de amostra de 5x(Tabela 1).</li>
	<li>Aqueça as amostras por 10 min a 92°C enquanto treme a 1000 rpm. As amostras podem então ser congeladas e mantidas a -20 °C.</li>
	<li>Carregue 20 μL de cada amostra e execute em um gel SDS-PAGE.</li>
	<li>Realize a análise de manchas ocidentais usando anticorpos apropriados para determinar a estabilidade relativa da proteína.</li>
	<li>Determine a intensidade das bandas usando software densitométrico, como o módulo de gel ImageJ livremente disponível. Normalize todos os valores para aqueles medidos na amostra de controle(s). NOTA: O objetivo do knockdown RNAi em nossas telas é diminuir os níveis proteicos de um acompanhante/co-acompanhante específico. Assim, a melhor maneira de avaliar a eficiência do knockdown rnai é pela análise de manchas ocidentais. Isso requer anticorpos específicos. Alternativamente, o qPCR pode ser usado para quantificar os níveis de mRNA.</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Uma imagem integrada da rede de proteostase refletindo como ela é organizada e funciona em diferentes células metazoanas e tecidos permanece em falta. Para supridamente essa deficiência, são necessárias informações específicas sobre as interações de diversos componentes dessa rede, como acompanhantes moleculares, em tecidos específicos durante o desenvolvimento e envelhecimento. Aqui, mostramos como o uso de perturbações específicas do tecido nos permitiu examinar a rede de acompanhantes em um determinado t...

As células lidam com danos proteicos empregando máquinas de controle de qualidade que reparam, sequeram ou removem quaisquer proteínas danificadas1,2. O dobrável e a montagem de complexos proteicos são suportados por acompanhantes moleculares, um grupo diversificado de proteínas altamente conservadas que podem reparar ou sequestrar proteínas danificadas3,4,5,6,7. A remoção de proteínas danificadas é mediada pelo sistema ubiquitina-proteasome (UPS)8 ou pelo maquinário de autofagia9 em colaboração com acompanhantes10,11,12. A homeostase proteica (proteostase) é, portanto, mantida por redes de controle de qualidade compostas por máquinas dobráveis e degradantes3,13. No entanto, entender as interações entre os diversos componentes da rede de proteostasis in vivo é um grande desafio. Enquanto as telas de interação proteína-proteína contribuem com informações importantes sobre interações físicas e complexos de acompanhantes14,15, falta compreender a organização e mecanismos compensatórios dentro de redes de acompanhantes específicas do tecido in vivo.
As interações genéticas são frequentemente usadas como uma ferramenta poderosa para examinar a relação entre pares de genes que estão envolvidos em vias biológicas comuns ou compensatórias16,17,18. Tais relações podem ser medidas combinando pares de mutações e quantificando o impacto de uma mutação em um gene sobre a gravidade fenotípica causada por uma mutação no segundo gene16. Embora a maioria dessas combinações não demonstre efeito em termos de fenótipo, algumas interações genéticas podem agravar ou aliviar a gravidade do fenótipo medido. Mutações agravantes são observadas quando o fenótipo do mutante de dupla exclusão é mais grave do que o fenótipo esperado visto ao combinar os mutantes de exclusão única, implicando que os dois genes funcionam em caminhos paralelos, afetando juntos uma determinada função. Em contraste, mutações aliviadas são observadas quando o fenótipo do mutante de dupla exclusão é menos grave do que o fenótipo visto com os mutantes de exclusão única, implicando que os dois genes agem juntos como um complexo ou participam da mesma via16,18. Assim, diversos fenótipos que podem ser quantificados, incluindo fenótipos amplos, como letalidade, taxas de crescimento e tamanho de ninhadas, bem como fenótipos específicos, como repórteres transcricionais, têm sido usados para identificar interações genéticas. Por exemplo, Jonikas et al. contaram com um repórter de estresse do PS para examinar as interações do Saccharomyces cerevisiae ER desdobrado rede de proteostase de resposta à proteína usando análises de exclusão genética de pairwise19.
As telas de interação genética envolvem cruzar sistematicamente mutações de exclusão pares para gerar um conjunto abrangente de mutantes duplos20. No entanto, em modelos animais, e especificamente em C. elegans,essa abordagem em larga escala não é viável. Em vez disso, cepas mutantes podem ser testadas para seus padrões de interação genética através da expressão genética de baixa regulação usando a interferência de RNA (RNAi)21. C. elegans é um poderoso sistema para telas baseados em RNAi22,23. Em C. elegans,a entrega de RNA (dsRNA) de duplar encalha é alcançada pela alimentação bacteriana, levando à disseminação de moléculas de dsRNA para numerosos tecidos. Dessa forma, as moléculas de dsRNA introduzidas impactam o animal através de um procedimento rápido e simples21. Uma tela de interação genética usando RNAi pode, portanto, revelar o impacto da regulação de um conjunto de genes ou da maioria dos genes codificadores C. elegans usando bibliotecas RNAi24. Em tal tela, hits que impactam o comportamento do mutante de interesse, mas não a cepa do tipo selvagem são modificadores potenciais do fenótipo sendomonitorados 25. Aqui, aplicamos uma combinação de mutações e triagem RNAi para mapear sistematicamente interações de acompanhantes específicas de tecidos em C. elegans.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well-plates</td>
			<td>SPL</td>
			<td>BA3D16B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mm plates</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>627160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm plates</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>628102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well 2 mL 128.0/85mm</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>780278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>AGA03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>69-52-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BO126-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02382.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td>q30548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0433-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SCGPUO2RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ165FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Frutarom</td>
			<td>2355519000024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>367-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04873.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>001649029100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22189-08-8</td>
			<td>Gift from the Morimoto laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin MHC A (MYO-3) antibody</td>
			<td>Hybridoma Bank</td>
			<td>5-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;7H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>s-0751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>001903029100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>61930705001730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate pouring pump</td>
			<td>Integra</td>
			<td>does it p920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAi Chaperone library</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>0837-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#223;-mercaptoethanol</td>
			<td>Bio world</td>
			<td>41300000-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>64-75-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>002009239100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using caenorhabditis elegans to screen for tissue-specific chaperone interactions

A dobra correta e a montagem de proteínas e complexos proteicos são essenciais para a função celular. As células empregam vias de controle de qualidade que corrijam, sequestram ou eliminam proteínas danificadas para manter um proteome saudável, garantindo assim proteostase celular e prevenindo danos adicionais à proteína. Devido a funções redundantes dentro da rede de proteostase, a triagem de fenótipos detectáveis usando knockdown ou mutações em genes codificadores de acompanhantes no organismo multicelular Caenorhabditis elegans resulta na detecção de fenótipos menores ou não na maioria dos casos. Desenvolvemos uma estratégia de triagem direcionada para identificar acompanhantes necessários para uma função específica e, assim, preencher a lacuna entre fenótipo e função. Especificamente, monitoramos interações de acompanhantes novos usando telas de interação sintética RNAi, expressão de acompanhante, um acompanhante de cada vez, em animais carregando uma mutação em um gene codificante de acompanhantes ou expressando demais um acompanhante de interesse. Ao interromper dois acompanhantes que individualmente não apresentam fenótipo bruto, podemos identificar acompanhantes que agravam ou expõem um fenótipo específico quando ambos perturbados. Demonstramos que essa abordagem pode identificar conjuntos específicos de acompanhantes que funcionam juntos para modular a dobra de um complexo de proteínas ou proteínas associados a um determinado fenótipo.

Usando mutações sensíveis à temperatura no UNC-45 para testar para agravar ou aliviar interações em condições permissivas ou restritivas, respectivamente A montagem e manutenção muscular oferecem um sistema eficaz para estudar interações de acompanhantes específicas do tecido. A unidade funcional de músculos contratuais, o sarcomere, apresenta um arranjo cristalino de proteínas estruturais e regulatórias. A estabilidade da miose da proteína motora e sua incorporação nos filamentos e...

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Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Para estudar as interações acompanhante-acompanhante e acompanhante-substrato, realizamos telas de interação sintética em elegans caenorhabditis usando interferência de RNA em combinação com mutações leves ou sobre-expressão de acompanhantes e monitorar disfunção proteica específica do tecido no nível do organismo.

Usando elegans caenorhabditis para tela para interações de acompanhantes específicas de tecido

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...

using-caenorhabditis-elegans-to-screen-for-tissue-specific-chaperone

Research

JoVE Journal

Biology

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

2.8K visualizações.  Ben-Gurion University of the Negev. Para estudar as interações acompanhante-acompanhante e acompanhante-substrato, realizamos telas de interação sintética em elegans caenorhabditis usando interferência de RNA em combinação com mutações leves ou sobre-expressão de acompanhantes e monitorar disfunção proteica específica do tecido no nível do organismo.

Vídeo: Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Básico<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Métodos: Sincronização e observação

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Biologia

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

Usando RNA mediada estratégia de alimentação Interferência em tela para genes envolvidos na regulação do tamanho corporal na Nemátodo<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, and participate in various signaling pathways. Caenorhabditis elegans synthesizes all of the enzymes necessary to produce a range of omega-6 and omega-3 fatty acids. This, combined with the simple anatomy and range of available genetic tools, make it an attractive model to study fatty acid function. In order to investigate the genetic pathways that mediate the physiological effects of dietary fatty acids, we have developed a method to supplement the C. elegans diet with unsaturated fatty acids. Supplementation is an effective means to alter the fatty acid composition of worms and can also be used to rescue defects in fatty acid-deficient mutants. Our method uses nematode growth medium agar (NGM) supplemented with fatty acidsodium salts. The fatty acids in the supplemented plates become incorporated into the membranes of the bacterial food source, which is then taken up by the C. elegans that feed on the supplemented bacteria. We also describe a gas chromatography protocol to monitor the changes in fatty acid composition that occur in supplemented worms. This is an efficient way to supplement the diets of both large and small populations of C. elegans, allowing for a range of applications for this method.

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a useful model to explore the functions of polyunsaturated fatty acids in development and physiology. This protocol describes an efficient method of supplementing the C. elegans diet with polyunsaturated fatty acids.

A suplementação dietética de ácidos graxos poliinsaturados em<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, ...

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode&#8217;s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.

A rastreï¿½el<em&gt; In Vivo</em&gt; Ensaio para mitocondrial Modulators Usando Transgenic Bioluminescent<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These age-associated disorders are characterized by the appearance of protein aggregates with fibrillary structure in the brains of these patients. Exactly why normally soluble proteins undergo an aggregation process remains poorly understood. The discovery that protein aggregation is not limited to disease processes and instead part of the normal aging process enables the study of the molecular and cellular mechanisms that regulate protein aggregation, without using ectopically expressed human disease-associated proteins. Here we describe methodologies to examine inherent protein aggregation in Caenorhabditis elegans through complementary approaches. First, we examine how to grow large numbers of age-synchronized C. elegans to obtain aged animals and we present the biochemical procedures to isolate highly-insoluble-large aggregates. In combination with a targeted genetic knockdown, it is possible to dissect the role of a gene of interest in promoting or preventing age-dependent protein aggregation by using either a comprehensive analysis with quantitative mass spectrometry or a candidate-based analysis with antibodies. These findings are then confirmed by in vivo analysis with transgenic animals expressing fluorescent-tagged aggregation-prone proteins. These methods should help clarify why certain proteins are prone to aggregate with age and ultimately how to keep these proteins fully functional.

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

The goal of the method presented here is to explore protein aggregation during normal aging in the model organism C. elegans. The protocol represents a powerful tool to study the highly insoluble large aggregates that form with age and to determine how changes in proteostasis impact protein aggregation.

Métodos de estudo mudanças na agregação de proteínas inerente com a idade em Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a growing number of age-associated diseases. For instance, proteins with polyglutamine expansions are prone to aggregation, as exemplified with the huntingtin protein and concomitant onset of Huntington&#8217;s disease. The age-associated deterioration of the proteome has been widely studied through the use of transgenic Caenorhabditis elegans expressing polyQ repeats fused to a yellow fluorescent protein (YFP). This polyQ::YFP transgenic animal model facilitates the direct quantification of the age-associated decline of the proteome through imaging the progressive formation of fluorescent foci (i.e., protein aggregates) and subsequent onset of locomotion defects that develop as a result of the collapse of the proteome. Further, the expression of the polyQ::YFP transgene can be driven by tissue-specific promoters, allowing the assessment of proteostasis across tissues in the context of an intact multicellular organism. This model is highly amenable to genetic analysis, thus providing an approach to quantify aging that is complementary to lifespan assays. We describe how to accurately measure polyQ::YFP foci formation within either neurons or body wall muscle during aging, and the subsequent onset of behavioral defects. Next, we highlight how these approaches can be adapted for higher throughput, and potential future applications using other emerging strategies for C. elegans genetic analysis.

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Proteostatic decline is a hallmark of aging, facilitating the onset of neurodegenerative diseases. We outline a protocol to quantifiably measure proteostasis in two different Caenorhabditis elegans tissues through heterologous expression of polyglutamine repeats fused to a fluorescent reporter. This model allows rapid in vivo genetic analysis of proteostasis.

Quantificando o declínio proteostático específico do tecido em elegans caenorhabditis

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their detrimental effects on the human life quality and the healthcare system, the majority of human neurodegenerative disorders still remain incurable and non-preventable. Therefore, the development of novel therapeutic interventions against such maladies is becoming a pressing urgency. Age-associated deterioration of neuronal circuits and function is evolutionarily conserved in organisms as diverse as the lowly worm Caenorhabditis elegans and humans, signifying similarities in the underlying cellular and molecular mechanisms. C. elegans is a highly malleable genetic model, which offers a well-characterized nervous system, body transparency and a diverse repertoire of genetic and imaging techniques to assess neuronal activity and quality control during ageing. Here, we introduce and describe methodologies utilizing some versatile nematode models, including hyperactivated ion channel-induced necrosis (e.g., deg-3(d) and mec-4(d)) and protein aggregate (e.g., &#945;-syunclein and poly-glutamate)-induced neurotoxicity, to monitor and dissect the cellular and molecular underpinnings of age-related neuronal breakdown. A combination of these animal neurodegeneration models, together with genetic and pharmacological screens for cell death modulators will lead to an unprecedented understanding of age-related breakdown of neuronal function and will provide critical insights with broad relevance to human health and quality of life.

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Here, we introduce and describe widely accessible methodologies utilizing some versatile nematode models, including hyperactivated ion channel-induced necrosis and protein aggregate-induced neurotoxicity, to monitor and dissect the cellular and molecular underpinnings of age-associated neurodegenerative diseases.

Modelagem de Doenças Neurodegenerativas Associadas à Idade em Caenorhabditis elegans

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their ...

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

The nematode Caenorhabditis elegans is a model system for host-microbe and host-microbiome interactions. Many studies to date use batch digests rather than individual worm samples to quantify bacterial load in this organism. Here it is argued that the large inter-individual variability seen in bacterial colonization of the C. elegans intestine is informative, and that batch digest methods discard information that is important for accurate comparison across conditions. As describing the variation inherent to these samples requires large numbers of individuals, a convenient 96-well plate protocol for disruption and colony plating of individual worms is established.

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

This protocol describes a 96-well disruption of individual bacterially colonized Caenorhabditis elegans following cold paralysis and surface bleaching&#160;to remove external bacteria. The resulting suspension is plated on agar plates to allow accurate, medium-throughput quantification of bacterial load in large numbers of individual worms.

Usando dados de verme único para quantificar a heterogeneidade em Interações elegans-bacterianas de Caenorhabditis

The nematode Caenorhabditis elegans is a model system for host-microbe and host-microbiome interactions. Many studies to date use batch digests rather ...

Quantificando a mitofagia em C. elegans e uma linha celular de câncer de fígado

Detection of Mitophagy in Caenorhabditis elegans and Mammalian Cells Using Organelle-Specific Dyes

Mitochondria are essential for various biological functions, including energy production, lipid metabolism, calcium homeostasis, heme biosynthesis, regulated cell death, and the generation of reactive oxygen species (ROS). ROS are vital for key biological processes. However, when uncontrolled, they can lead to oxidative injury, including mitochondrial damage. Damaged mitochondria release more ROS, thereby intensifying cellular injury and the disease state. A homeostatic process named mitochondrial autophagy (mitophagy) selectively removes damaged mitochondria, which are then replaced by new ones. There are multiple mitophagy pathways, with the common endpoint being the breakdown of the damaged mitochondria in lysosomes. 
Several methodologies, including genetic sensors, antibody immunofluorescence, and electron microscopy, use this endpoint to quantify mitophagy. Each method for examining mitophagy has its advantages, such as specific tissue/cell targeting (with genetic sensors) and great detail (with electron microscopy). However, these methods often require expensive resources, trained personnel, and a lengthy preparation time before the actual experiment, such as for creating transgenic animals. Here, we present a cost-effective alternative for measuring mitophagy using commercially available fluorescent dyes targeting mitochondria and lysosomes. This method effectively measures mitophagy in the nematode Caenorhabditis elegans and human liver cells, which indicates its potential efficiency in other model systems.

Autor em destaque: Detecção de mitofagia em Caenorhabditis elegans e células de mamíferos usando corantes específicos de organelas  

Exploring mitophagy through electron microscopy, genetic sensors, and immunofluorescence requires costly equipment, skilled personnel, and a significant time investment. Here, we demonstrate the efficacy of a commercial fluorescence dye kit in quantifying the mitophagy process in both Caenorhabditis elegans and a liver cancer cell line.

Detecção de Mitofagia em Caenorhabditis elegans e Células de Mamíferos Usando Corantes Organel-Específicos

Mitochondria are essential for various biological functions, including energy production, lipid metabolism, calcium homeostasis, heme biosynthesis, ...