Agradecemos al Centro de Genética Caenorhabditis, financiado por el Centro Nacional de Recursos de Investigación (NCRR) de los NIH, por algunas de las cepas de nematodos. Los anticuerpos monoclonales desarrollados por H.F. Epstein se obtuvieron del Developmental Studies Hybridoma Bank desarrollado bajo los auspicios del NICHD y mantenido por el Departamento de Biología de la Universidad de Iowa. Esta investigación fue apoyada por una subvención de la Fundación de Ciencias de Israel (subvención No. 278/18) y por una subvención del Ministerio de Ciencia y Tecnología de Israel, y el Ministerio de Relaciones Exteriores y Cooperación Internacional, Dirección General de Promoción del País, República Italiana (subvención No. 3-14337). Agradecemos a los miembros del laboratorio Ben-Zvi por su ayuda en la preparación de este manuscrito.

1. Preparación de placas de medios de crecimiento de nematodos para RNAi
<ol><li>A una botella de 1 L, agregue 3 g de NaCl, 2,5 g de Bacto-Peptona, 17 g de agar y agua destilada hasta 1 L y autoclave.</li>
	<li>Enfríe la botella a 55 °C.</li>
	<li>Añadir 25 mL de 1 M KH2PO4, pH 6.0, 1 mL de 1 M CaCl2, 1 mL de 1 M MgSO4, y 1 mL de solución de colesterol (Tabla 1) para hacer nematodos medios de crecimiento (NGM).</li>
	<li>Añadir 1 ml de ampicilina (100 mg/ml) y 0,5 ml de 1 M de IPTG (Tabla 1) para hacer la solución de NGM-ARNi. NOTA: La bacteria E. coli HT115 (DE3) de uso común contiene una ADN polimerasa T7 inducible por IPTG utilizada para expresar los plásmidos que codifican dsRNA. Estos plásmidos también codifican para la resistencia a la ampicilina.</li>
	<li>Mezcle la solución tibia removiendo la botella.</li>
	<li>En la campana o utilizando procedimientos estériles, vierta la solución de NGM en placas o usando una bomba peristáltica, dispense la solución en placas. Utilice placas de 6 pozos, 12 pozos, 40 mm o 60 mm para esta pantalla. El agar debe llenar aproximadamente 2/3 de la profundidad de la placa.</li>
	<li>Deje que las placas se sequen durante la noche en el banco a temperatura ambiente, manteniendo las placas cubiertas. Las placas NGM para RNAi se pueden almacenar a 4 °C durante un mes.</li>
</ol>2. Cultivo de bacterias RNAi y siembra de las placas
<ol><li>En la campana o mediante procedimientos estériles, añadir 1 ml de ampicilina (100 mg/ml) y 2,5 ml de tetraciclina (5 mg/ml) (Tabla 1) a una solución de LB de 1 L preautoclave y mezclar. NOTA: Las bacterias HT115 (DE3) E. coli de uso común son resistentes a la tetraciclina.</li>
	<li>En la campana o utilizando procedimientos estériles, agregue 600 μL de solución de LB a cada pozo en placas estériles de 96 ormentos de 2 ml de profundidad. Lo mejor es utilizar una pipeta multicanal para dispensar los medios.</li>
	<li>Mediante procedimientos estériles, inocular pozos con bacterias HT115(DE3) E. coli transformadas con un plásmido codificante de dsRNA dirigido a un gen de interés o a un plásmido vacío, como control. Cubra las placas e incube a 37 °C durante la noche. Las bibliotecas que consisten en clones bacterianos que expresan dsRNA, correspondientes a ~ 94% de los genes predichos de C. elegans se construyeron previamente22,23 y están disponibles comercialmente. La biblioteca de acompañantes utilizada aquí fue construida por el laboratorio del Dr. Richard Morimoto26.</li>
	<li>Utilizando procedimientos estériles, seeste 75, 150 o 250 μL de bacterias en las placas de ARNi NGM de 12 pozos, 40 mm y 6 o 60 mm, respectivamente. Marque claramente el nombre del gen objetivo en la placa. Las bacterias deben cubrir el 30-50% de la superficie del agar y no deben tocar los bordes de la placa.</li>
	<li>Deje que las placas se sequen durante al menos 2 días en el banco a temperatura ambiente, manteniendo las placas cubiertas. NOTA: Las placas se pueden incubar a 37 °C durante la noche. Asegúrese de que los pozos interiores estén secos antes de usar o almacenar las placas. Para todos los fines a largo plazo (es decir, secado o almacenamiento) mantenga las placas en la oscuridad. Las placas secas y secuedradas se pueden almacenar a 4 °C hasta por un mes.</li>
</ol>3. Sincronización no estresante de embriones
<ol><li>Use una púa de gusano para mover alrededor de 100 huevos de una placa de gusano no sincronizada a una placa NGM recién secuenada.</li>
	<li>Cultive animales durante 5 días a 15 °C, 3,5 días a 20 °C o 2,5 días a 25 °C. Los animales deben llegar al primer día de puesta de huevos. NOTA: Los gusanos se cultivan comúnmente a 20 ° C. Sin embargo, diferentes cepas mutantes chaperonas pueden requerir temperaturas de cultivo específicas. Por ejemplo, muchas cepas sensibles a la temperatura se cultivan a 15 °C, pero se desplazan a 25 °C para exponer su fenotipo.</li>
	<li>Agregue 1 ml de tampón M9(Tabla 1)lentamente y lejos del césped bacteriano. Gire la placa para que el tampón cubra completamente la placa. Luego inclínelo hacia un lado y retire el líquido del plato y lave a los animales del plato. NOTA: Cuando se utilizan animales sensibles a la temperatura o mutantes chaperones, es mejor mantener los tampones utilizados en el protocolo a la temperatura de cultivo de los animales.</li>
	<li>Repita el paso 3.3 tres veces o hasta que todos los animales se laven del plato.</li>
	<li>Usando una punta de plástico estándar, corte un cuadrado de agar del plato lavado donde se concentran los huevos y coloque el trozo de agar en un plato NGM recién sembrado. NOTA: Se requieren ~ 200 huevos para producir suficientes animales que ponen huevos; demasiados animales consumen la bacteria demasiado rápido. Los niveles bajos de alimentos pueden afectar la proteostasis27.</li>
	<li>Cultive los animales durante 5 días a 15 °C, 3,5 días a 20 °C o 2,5 días a 25 °C. En este punto, las placas deben cubrirse con huevos sincronizados. NOTA: Los animales se pueden cambiar a una nueva placa durante un corto período de tiempo para una sincronización más estricta. Sin embargo, es importante usar solo adultos en las primeras etapas de la puesta de huevos, ya que los animales pueden retener los huevos en su útero afectando la sincronización.</li>
	<li>Agregue 1 ml de tampón M9 lentamente y lejos del césped bacteriano.</li>
	<li>Gire la placa para que el tampón cubra completamente la placa. Luego inclínelo hacia un lado y retire el líquido del plato y lave a los animales del plato.</li>
	<li>Repita el paso 3.7 tres veces o hasta que todos los animales se laven del plato.</li>
	<li>Agregue 1 ml de tampón M9 y use un raspador de células para liberar los huevos de la placa.</li>
	<li>Recoge el tampón M9 que contiene los huevos de las placas.</li>
	<li>Centrifugar el tampón M9 que contiene los huevos a 3.000 x g durante 2 min.</li>
	<li>Retire el sobrenadante y agregue el búfer M9 para alcanzar un volumen de 1 ml.</li>
	<li>Resuspenda los huevos para interrumpir cualquier trozo de huevos y bacterias.</li>
	<li>Repita el procedimiento de lavado descrito en los pasos 3.11-3.13 cinco veces. El pellet de huevo debe aparecer blanco. Si todavía es amarillo / marrón, repita el lavado hasta que se alcance un gránulo blanco. NOTA: Las bacterias que permanecen en los huevos pueden contaminar las bacterias que expresan dsRNA.</li>
	<li>Retire la mayor parte del sobrenadante, dejando unos 200 μL. Los huevos sincronizados se pueden usar para pantallas de ARNi.</li>
</ol>4. Ensayos fenotípicos comunes
<ol><li>Cultivo de animales durante experimentos<ol>
<li>Coloque una gota de ~ 30 huevos cerca del césped bacteriano en cada placa con semillas de ARNi. Como referencia, también coloque ~ 30 huevos en placas secuesdas con bacterias vacías que contienen vectores (L4440).</li>
		<li>Cultive animales sincronizados por la edad en placas con semillas de ARNi NGM. La duración del experimento dependerá de la etapa en la que se controlará a los animales y de la temperatura de cultivo. Ajuste la temperatura de cultivo cuando use animales mutantes sensibles a la temperatura. Ajuste la duración del cultivo cuando use animales mutantes con retraso en el desarrollo. NOTA: Si bien el tiempo puede variar, una vez que los animales alcanzan la edad adulta, la puesta de huevos (y el consumo rápido de alimentos resultante), así como el colapso de proteostsis dependiente de la edad28, podrían afectar los resultados. Por lo tanto, se recomienda puntuar a los animales antes del inicio de la puesta de huevos (día 1 de la edad adulta). Los animales de tipo salvaje alcanzan esta etapa después de 4,5 días a 15 °C, 3 días a 20 °C o 2 días a 25 °C.</li>
		<li>El número de repeticiones utilizadas dependerá del tamaño del conjunto de genes examinado. Para la biblioteca de chaperonas (97 genes), repita los experimentos al menos cuatro veces. El tamaño de la población depende del ensayo utilizado. En los ensayos de comportamiento discutidos aquí, puntúa >15 animales por condición experimental en cada repetición. Los datos y los análisis estadísticos también dependen en gran medida del tipo de ensayo utilizado. Los datos en los ensayos discutidos aquí se pueden presentar como medios ± SEM.</li>
		<li>Compare los animales tratados con ARNi y control de vectores vacíos como poblaciones independientes. Los valores de P se pueden calcular utilizando ANOVA unidireccional o bidireccional, dependiendo de los cambios examinados, es decir, agravando o aliviando solo o ambos. Al examinar un solo tratamiento de ARNi frente a control, los valores de P se pueden calcular utilizando la prueba de suma de rango de Mann-Whitney unidirección o bidireccional. Aparte de la significación estadística, considere un umbral para los aciertos basado en el grado de impacto en el fenotipo.</li>
	</ol></li>
	<li>Detención/retraso en el desarrollo<ol>
<li>Cultive animales sincronizados por edad como en el paso 4.1 hasta que los animales cultivados en bacterias de control que contienen vectores vacíos alcancen la edad adulta, pero antes de que comience la puesta de huevos.</li>
		<li>Monitoree a los animales usando un estereomicroscópica y cuente el número de larvas y adultos para calificar el porcentaje de animales con retraso en el desarrollo. Como referencia, compare con animales mutantes cultivados en bacterias de control que contienen vectores vacíos. El tratamiento con ARNi hsp-1 o hsp-90 da como resultado la detención del desarrollo de animales de tipo salvaje y se puede utilizar como un control positivo.</li>
		<li>Para calificar el porcentaje de animales con retraso en el desarrollo a lo largo del tiempo, repita el paso 4.2.2. NOTA: Si hay adultos que ponen huevos en el plato, transfiera los animales retrasados por el desarrollo a una nueva placa NGM-RNAi etiquetada para el mismo gen objetivo para evitar confusiones con la progenie.</li>
	</ol></li>
	<li>Defectos de esterilidad o puesta de huevos<ol>
<li>Cultive animales sincronizados por edad como en el paso 4.1 hasta que los animales cultivados en bacterias vacías de control de vectores comiencen a poner huevos.</li>
		<li>Monitoree a los animales usando un estereomiroscopio y puntúe el porcentaje de animales sin óvulos visibles en su útero. Como referencia, compare con animales mutantes cultivados en bacterias vacías de control de vectores.</li>
		<li>Alternativamente, monitoree a los animales usando un estereomiroscopio y puntúe el porcentaje de animales con un útero lleno de huevos, definido como EGg Poneción defectuosa (Egl-d) fenotipo29.</li>
	</ol></li>
	<li>Letalidad embrionaria<ol>
<li>Cultive animales sincronizados por edad como en el paso 4.1 hasta que los animales comiencen a poner huevos.</li>
		<li>Transfiera ~ 100 huevos a un plato vacío. Extiende los huevos en filas para simplificar el conteo.</li>
		<li>Anote el porcentaje de huevos no eclostos en el plato después de 24-48 horas. Como referencia, compare con los huevos de animales tratados con bacterias de control de vectores vacías.</li>
	</ol></li>
	<li>Ensayo de parálisis<ol>
<li>Para los adultos del día 1, cultive animales sincronizados por la edad como en el paso 4.1 hasta que los animales cultivados en bacterias vacías de control de vectores alcancen la edad adulta, pero antes de que comience la puesta de huevos.</li>
		<li>Dibuja una línea en la parte posterior de una placa de agar NGM normal usando un marcador fino.</li>
		<li>Coloque de 5 a 10 animales en la línea marcada.</li>
		<li>Configure un temporizador y espere 10 minutos.</li>
		<li>Puntúe el porcentaje de animales que permanecen en la línea como gusanos paralizados. Como referencia, compare con animales mutantes cultivados en bacterias vacías de control de vectores. Los animales de tipo salvaje tratados con ARNi unc-45 muestran un fenotipo de parálisis severa y pueden usarse como control positivo. NOTA: Este ensayo destaca a los animales que muestran parálisis media a severa. Tales animales generalmente se encuentran rectos en el plato, en lugar de presentar la forma curva común. Además, un parche limpio de bacterias es visible alrededor de las cabezas de los gusanos paralizados.</li>
	</ol></li>
	<li>Ensayo de golpiza<ol>
<li>Cultive animales sincronizados por la edad como en el paso 4.1 hasta que los animales cultivados con bacterias vacías de control de vectores alcancen la edad adulta, pero antes de que comience la puesta de huevos.</li>
		<li>Pipete 100 μL de tampón M9 a la temperatura de cultivo de los animales en una placa de 96 pozos.</li>
		<li>Coloque ~ 15 gusanos, uno por pozo, en los pozos que contienen tampón M9.</li>
		<li>Deje que los animales se ajusten durante 5 min.</li>
		<li>Examine a cada animal bajo el estereomitroscopio, inicie un temporizador contando 15 s y cuente el número de curvas corporales que cada animal realiza en ese período de tiempo. Los valores contados se pueden normalizar a curvas corporales por minuto. Como referencia, compare con animales mutantes cultivados en bacterias vacías de control de vectores. NOTA: Este ensayo de motilidad es muy sensible y puede detectar diferencias muy leves entre los tratamientos. Sin embargo, la motilidad en líquido y la motilidad en agar pueden diferir.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Validación del derribo de proteínas
<ol><li>Coloque 250-300 huevos sincronizados en una placa NGM-RNAi de 60 mm secuesta con las bacterias relevantes que expresan dsRNA o que contienen vectores vacíos (L4440). NOTA: El derribo de ARNi podría resultar en una acumulación aberrante de embriones, en una falta de embriones o en una detención del desarrollo que podría afectar la expresión génica. Esto debe tenerse en cuenta al determinar la edad de los animales que se examinarán.</li>
	<li>Para adultos del día 1, cultive animales durante 4,5 días a 15 °C, 3 días a 20 °C o 2 días a 25 °C.</li>
	<li>Recoger y transferir un total de 200 animales adultos jóvenes a la tapa de un relleno de tubo de 1,5 ml con 200 μL de PBS-T. NOTA: Cuando se utilizan animales sensibles a la temperatura o mutantes chaperones, es mejor mantener los tampones utilizados en el protocolo a la temperatura de cultivo de los animales.</li>
	<li>Cierre la tapa con cuidado y centrífuga a 1.000 x g durante 1 min.</li>
	<li>Añadir 800 μL de PBS-T(Tabla 1)y centrifugar a 1.000 x g durante 1 min.</li>
	<li>Retire con cuidado los 900 μL superiores.</li>
	<li>Repita los pasos 5.4-5.6 tres veces.</li>
	<li>Retire 900 μL, dejando 100 μL de solución que contiene los 200 gusanos.</li>
	<li>Añadir 25 μL de búfer de muestra 5x (Tabla 1).</li>
	<li>Calentar las muestras durante 10 min a 92°C mientras agita a 1000 rpm. Las muestras pueden congelarse y conservarse a -20 °C.</li>
	<li>Cargue 20 μL de cada muestra y ejecute en un gel SDS-PAGE.</li>
	<li>Realizar análisis de western blot utilizando anticuerpos apropiados para determinar la estabilidad relativa de la proteína.</li>
	<li>Determine la intensidad de las bandas utilizando software densitométrico, como el módulo de gel ImageJ disponible gratuitamente. Normalice todos los valores a los medidos en la(s) muestra(s) de control. NOTA: El objetivo de la eliminación de ARNi en nuestras pantallas es reducir los niveles de proteína de una chaperona / co-chaperona específica. Por lo tanto, la mejor manera de evaluar la eficiencia del derribo de ARNi es mediante el análisis de western blot. Esto requiere anticuerpos específicos. Alternativamente, la qPCR se puede utilizar para cuantificar los niveles de ARNm.</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Sigue faltando una imagen integrada de la red de proteostasis que refleje cómo está organizada y funciona en diferentes células y tejidos metazoarios. Para abordar esta deficiencia, se requiere información específica sobre las interacciones de varios componentes de esta red, como las chaperonas moleculares, en tejidos específicos durante el curso del desarrollo y el envejecimiento. Aquí, mostramos cómo el uso de perturbaciones específicas del tejido nos permitió examinar la red de chaperonas en un tejido dado. ...

Las células hacen frente al daño de las proteínas mediante el empleo de maquinarias de control de calidad que reparan, secuestran o eliminan cualquier proteína dañada1,2. El plegamiento y el ensamblaje de complejos de proteínas están respaldados por chaperonas moleculares, un grupo diverso de proteínas altamente conservadas que pueden reparar o secuestrar proteínas dañadas3,4,5,6,7. La eliminación de proteínas dañadas está mediada por el sistema ubiquitina-proteasoma (UPS)8 o por la maquinaria de autofagia9 en colaboración con chaperonas10,11,12. La homeostasis proteica (proteostasis) se mantiene, por lo tanto, mediante redes de control de calidad compuestas por maquinarias de plegamiento y degradación3,13. Sin embargo, comprender las interacciones entre los diversos componentes de la red de proteostasis in vivo es un desafío importante. Si bien las pantallas de interacción proteína-proteína aportan información importante sobre las interacciones físicas y los complejos de chaperonas14,15, es deficiente comprender la organización y los mecanismos compensatorios dentro de las redes de chaperonas específicas de los tejidos in vivo.
Las interacciones genéticas se utilizan a menudo como una herramienta poderosa para examinar la relación entre pares de genes que están involucrados en vías biológicas comunes o compensatorias16,17,18. Tales relaciones se pueden medir combinando pares de mutaciones y cuantificando el impacto de una mutación en un gen en la gravedad fenotípica causada por una mutación en el segundo gen16. Si bien la mayoría de estas combinaciones no muestran ningún efecto en términos de fenotipo, algunas interacciones genéticas pueden agravar o aliviar la gravedad del fenotipo medido. Las mutaciones agravantes se observan cuando el fenotipo del mutante de doble deleción es más grave que el fenotipo esperado visto al combinar los mutantes de deleción simple, lo que implica que los dos genes funcionan en vías paralelas, afectando juntos a una función dada. Por el contrario, se observan mutaciones de alivio cuando el fenotipo del mutante de doble deleción es menos grave que el fenotipo observado con los mutantes de deleción simple, lo que implica que los dos genes actúan juntos como un complejo o participan en la misma vía16,18. En consecuencia, se han utilizado diversos fenotipos que se pueden cuantificar, incluidos fenotipos amplios, como la letalidad, las tasas de crecimiento y el tamaño de la cría, así como fenotipos específicos, como los reporteros transcripcionales, para identificar interacciones genéticas. Por ejemplo, Jonikas et al. se basaron en un reportero de estrés de ER para examinar las interacciones de la red de proteostasis de respuesta proteica desplegada por Saccharomyces cerevisiae ER utilizando análisis de deleción de genes por pares19.
Las pantallas de interacción genética implican el cruce sistemático de mutaciones de deleción por pares para generar un conjunto completo de mutantes dobles20. Sin embargo, en modelos animales, y específicamente en C. elegans,este enfoque a gran escala no es factible. En cambio, las cepas mutantes pueden ser probadas por sus patrones de interacción genética mediante la regulación a la baja de la expresión génica utilizando la interferencia de ARN (RNAi)21. C. elegans es un potente sistema para pantallas basado en RNAi22,23. En C. elegans, laentrega de ARN de doble cadena (dsRNA) se logra mediante la alimentación bacteriana, lo que lleva a la propagación de moléculas de dsRNA a numerosos tejidos. De esta manera, las moléculas de dsRNA introducidas impactan al animal a través de un procedimiento rápido y sencillo21. Una pantalla de interacción genética utilizando RNAi puede, por lo tanto, revelar el impacto de la regulación a la baja de un conjunto de genes o la mayoría de los genes codificantes de C. elegans utilizando bibliotecas de RNAi24. En dicha pantalla, los golpes que impactan en el comportamiento del mutante de interés pero no en la cepa de tipo salvaje son potenciales modificadores del fenotipo que se está monitoreando25. Aquí, aplicamos una combinación de mutaciones y cribado de ARNi para mapear sistemáticamente las interacciones de chaperonas específicas de tejidos en C. elegans.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well-plates</td>
			<td>SPL</td>
			<td>BA3D16B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mm plates</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>627160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm plates</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>628102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well 2 mL 128.0/85mm</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>780278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>AGA03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>69-52-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BO126-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02382.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td>q30548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0433-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SCGPUO2RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ165FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Frutarom</td>
			<td>2355519000024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>367-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04873.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>001649029100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22189-08-8</td>
			<td>Gift from the Morimoto laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin MHC A (MYO-3) antibody</td>
			<td>Hybridoma Bank</td>
			<td>5-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;7H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>s-0751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>001903029100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>61930705001730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate pouring pump</td>
			<td>Integra</td>
			<td>does it p920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAi Chaperone library</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>0837-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#223;-mercaptoethanol</td>
			<td>Bio world</td>
			<td>41300000-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>64-75-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>002009239100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using caenorhabditis elegans to screen for tissue-specific chaperone interactions

El correcto plegamiento y ensamblaje de proteínas y complejos proteicos es esencial para la función celular. Las células emplean vías de control de calidad que corrigen, secuestran o eliminan las proteínas dañadas para mantener un proteoma saludable, asegurando así la proteostasis celular y previniendo un mayor daño proteico. Debido a las funciones redundantes dentro de la red de proteostasis, la detección de fenotipos detectables mediante el derribo o mutaciones en genes que codifican chaperonas en el organismo multicelular Caenorhabditis elegans da como resultado la detección de fenotipos menores o nulos en la mayoría de los casos. Hemos desarrollado una estrategia de detección dirigida para identificar las chaperonas necesarias para una función específica y, por lo tanto, cerrar la brecha entre el fenotipo y la función. Específicamente, monitoreamos las nuevas interacciones de chaperonas utilizando pantallas de interacción sintética de ARNi, derribando la expresión de chaperonas, una chaperona a la vez, en animales portadores de una mutación en un gen que codifica chaperona o sobreexpresando una chaperona de interés. Al interrumpir dos chaperonas que individualmente no presentan fenotipo grueso, podemos identificar chaperonas que agravan o exponen un fenotipo específico cuando ambas perturban. Demostramos que este enfoque puede identificar conjuntos específicos de chaperonas que funcionan juntas para modular el plegamiento de una proteína o complejos de proteínas asociados con un fenotipo dado.

Uso de mutaciones sensibles a la temperatura en UNC-45 para detectar interacciones agravantes o de alivio en condiciones permisivas o restrictivas, respectivamente El ensamblaje y mantenimiento muscular ofrece un sistema eficaz para estudiar las interacciones de chaperonas específicas del tejido. La unidad funcional de los músculos contráctiles, el sarcómero, presenta una disposición cristalina de proteínas estructurales y reguladoras. La estabilidad de la proteína motora miosina y su incorpora...

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Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Para estudiar las interacciones chaperona-chaperona y chaperona-sustrato, realizamos pantallas de interacción sintética en Caenorhabditis elegans utilizando interferencia de ARN en combinación con mutaciones leves o sobreexpresión de chaperonas y monitoreamos la disfunción proteica específica del tejido a nivel del organismo.

Uso de Caenorhabditis elegans para detectar interacciones de chaperonas específicas del tejido

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...

using-caenorhabditis-elegans-to-screen-for-tissue-specific-chaperone

Research

JoVE Journal

Biology

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

2.8K vistas.  Ben-Gurion University of the Negev. Para estudiar las interacciones chaperona-chaperona y chaperona-sustrato, realizamos pantallas de interacción sintética en Caenorhabditis elegans utilizando interferencia de ARN en combinación con mutaciones leves o sobreexpresión de chaperonas y monitoreamos la disfunción proteica específica del tejido a nivel del organismo.

Video: Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Básico<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Métodos de sincronización y de observación

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Investigación

Biología

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

El uso de ARN de interferencia mediada estrategia de alimentación para la detección de genes implicados en la regulación del cuerpo Tamaño del nematodo<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, and participate in various signaling pathways. Caenorhabditis elegans synthesizes all of the enzymes necessary to produce a range of omega-6 and omega-3 fatty acids. This, combined with the simple anatomy and range of available genetic tools, make it an attractive model to study fatty acid function. In order to investigate the genetic pathways that mediate the physiological effects of dietary fatty acids, we have developed a method to supplement the C. elegans diet with unsaturated fatty acids. Supplementation is an effective means to alter the fatty acid composition of worms and can also be used to rescue defects in fatty acid-deficient mutants. Our method uses nematode growth medium agar (NGM) supplemented with fatty acidsodium salts. The fatty acids in the supplemented plates become incorporated into the membranes of the bacterial food source, which is then taken up by the C. elegans that feed on the supplemented bacteria. We also describe a gas chromatography protocol to monitor the changes in fatty acid composition that occur in supplemented worms. This is an efficient way to supplement the diets of both large and small populations of C. elegans, allowing for a range of applications for this method.

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a useful model to explore the functions of polyunsaturated fatty acids in development and physiology. This protocol describes an efficient method of supplementing the C. elegans diet with polyunsaturated fatty acids.

La suplementación dietética de ácidos grasos poliinsaturados en<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, ...

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode&#8217;s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.

Un rastreable<em&gt; En Vivo</em&gt; Ensayo para mitocondrial Moduladores Usando transgénico bioluminiscente<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These age-associated disorders are characterized by the appearance of protein aggregates with fibrillary structure in the brains of these patients. Exactly why normally soluble proteins undergo an aggregation process remains poorly understood. The discovery that protein aggregation is not limited to disease processes and instead part of the normal aging process enables the study of the molecular and cellular mechanisms that regulate protein aggregation, without using ectopically expressed human disease-associated proteins. Here we describe methodologies to examine inherent protein aggregation in Caenorhabditis elegans through complementary approaches. First, we examine how to grow large numbers of age-synchronized C. elegans to obtain aged animals and we present the biochemical procedures to isolate highly-insoluble-large aggregates. In combination with a targeted genetic knockdown, it is possible to dissect the role of a gene of interest in promoting or preventing age-dependent protein aggregation by using either a comprehensive analysis with quantitative mass spectrometry or a candidate-based analysis with antibodies. These findings are then confirmed by in vivo analysis with transgenic animals expressing fluorescent-tagged aggregation-prone proteins. These methods should help clarify why certain proteins are prone to aggregate with age and ultimately how to keep these proteins fully functional.

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

The goal of the method presented here is to explore protein aggregation during normal aging in the model organism C. elegans. The protocol represents a powerful tool to study the highly insoluble large aggregates that form with age and to determine how changes in proteostasis impact protein aggregation.

Métodos de estudio cambios de agregación inherente de proteína con la edad en Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a growing number of age-associated diseases. For instance, proteins with polyglutamine expansions are prone to aggregation, as exemplified with the huntingtin protein and concomitant onset of Huntington&#8217;s disease. The age-associated deterioration of the proteome has been widely studied through the use of transgenic Caenorhabditis elegans expressing polyQ repeats fused to a yellow fluorescent protein (YFP). This polyQ::YFP transgenic animal model facilitates the direct quantification of the age-associated decline of the proteome through imaging the progressive formation of fluorescent foci (i.e., protein aggregates) and subsequent onset of locomotion defects that develop as a result of the collapse of the proteome. Further, the expression of the polyQ::YFP transgene can be driven by tissue-specific promoters, allowing the assessment of proteostasis across tissues in the context of an intact multicellular organism. This model is highly amenable to genetic analysis, thus providing an approach to quantify aging that is complementary to lifespan assays. We describe how to accurately measure polyQ::YFP foci formation within either neurons or body wall muscle during aging, and the subsequent onset of behavioral defects. Next, we highlight how these approaches can be adapted for higher throughput, and potential future applications using other emerging strategies for C. elegans genetic analysis.

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Proteostatic decline is a hallmark of aging, facilitating the onset of neurodegenerative diseases. We outline a protocol to quantifiably measure proteostasis in two different Caenorhabditis elegans tissues through heterologous expression of polyglutamine repeats fused to a fluorescent reporter. This model allows rapid in vivo genetic analysis of proteostasis.

Cuantificación de la disminución proteostática específica del tejido en Caenorhabditis elegans

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their detrimental effects on the human life quality and the healthcare system, the majority of human neurodegenerative disorders still remain incurable and non-preventable. Therefore, the development of novel therapeutic interventions against such maladies is becoming a pressing urgency. Age-associated deterioration of neuronal circuits and function is evolutionarily conserved in organisms as diverse as the lowly worm Caenorhabditis elegans and humans, signifying similarities in the underlying cellular and molecular mechanisms. C. elegans is a highly malleable genetic model, which offers a well-characterized nervous system, body transparency and a diverse repertoire of genetic and imaging techniques to assess neuronal activity and quality control during ageing. Here, we introduce and describe methodologies utilizing some versatile nematode models, including hyperactivated ion channel-induced necrosis (e.g., deg-3(d) and mec-4(d)) and protein aggregate (e.g., &#945;-syunclein and poly-glutamate)-induced neurotoxicity, to monitor and dissect the cellular and molecular underpinnings of age-related neuronal breakdown. A combination of these animal neurodegeneration models, together with genetic and pharmacological screens for cell death modulators will lead to an unprecedented understanding of age-related breakdown of neuronal function and will provide critical insights with broad relevance to human health and quality of life.

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Here, we introduce and describe widely accessible methodologies utilizing some versatile nematode models, including hyperactivated ion channel-induced necrosis and protein aggregate-induced neurotoxicity, to monitor and dissect the cellular and molecular underpinnings of age-associated neurodegenerative diseases.

Modelar enfermedades neurodegenerativas asociadas a la edad en Caenorhabditis elegans

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their ...

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

The nematode Caenorhabditis elegans is a model system for host-microbe and host-microbiome interactions. Many studies to date use batch digests rather than individual worm samples to quantify bacterial load in this organism. Here it is argued that the large inter-individual variability seen in bacterial colonization of the C. elegans intestine is informative, and that batch digest methods discard information that is important for accurate comparison across conditions. As describing the variation inherent to these samples requires large numbers of individuals, a convenient 96-well plate protocol for disruption and colony plating of individual worms is established.

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

This protocol describes a 96-well disruption of individual bacterially colonized Caenorhabditis elegans following cold paralysis and surface bleaching&#160;to remove external bacteria. The resulting suspension is plated on agar plates to allow accurate, medium-throughput quantification of bacterial load in large numbers of individual worms.

Uso de datos de un solo gusano para cuantificar la heterogeneidad en las interacciones caenorhabditis elegans-bacterianas

The nematode Caenorhabditis elegans is a model system for host-microbe and host-microbiome interactions. Many studies to date use batch digests rather ...

Cuantificación de la mitofagia en C. elegans y una línea celular de cáncer de hígado

Detection of Mitophagy in Caenorhabditis elegans and Mammalian Cells Using Organelle-Specific Dyes

Mitochondria are essential for various biological functions, including energy production, lipid metabolism, calcium homeostasis, heme biosynthesis, regulated cell death, and the generation of reactive oxygen species (ROS). ROS are vital for key biological processes. However, when uncontrolled, they can lead to oxidative injury, including mitochondrial damage. Damaged mitochondria release more ROS, thereby intensifying cellular injury and the disease state. A homeostatic process named mitochondrial autophagy (mitophagy) selectively removes damaged mitochondria, which are then replaced by new ones. There are multiple mitophagy pathways, with the common endpoint being the breakdown of the damaged mitochondria in lysosomes. 
Several methodologies, including genetic sensors, antibody immunofluorescence, and electron microscopy, use this endpoint to quantify mitophagy. Each method for examining mitophagy has its advantages, such as specific tissue/cell targeting (with genetic sensors) and great detail (with electron microscopy). However, these methods often require expensive resources, trained personnel, and a lengthy preparation time before the actual experiment, such as for creating transgenic animals. Here, we present a cost-effective alternative for measuring mitophagy using commercially available fluorescent dyes targeting mitochondria and lysosomes. This method effectively measures mitophagy in the nematode Caenorhabditis elegans and human liver cells, which indicates its potential efficiency in other model systems.

Autor destacado: Detección de mitofagia en Caenorhabditis elegans y células de mamíferos utilizando colorantes específicos de orgánulos  

Exploring mitophagy through electron microscopy, genetic sensors, and immunofluorescence requires costly equipment, skilled personnel, and a significant time investment. Here, we demonstrate the efficacy of a commercial fluorescence dye kit in quantifying the mitophagy process in both Caenorhabditis elegans and a liver cancer cell line.

Detección de mitofagia en Caenorhabditis elegans y células de mamíferos utilizando colorantes específicos de orgánulos

Mitochondria are essential for various biological functions, including energy production, lipid metabolism, calcium homeostasis, heme biosynthesis, ...