Ringraziamo il Caenorhabditis Genetics Center, finanziato dal NIH National Center for Research Resources (NCRR), per alcuni dei ceppi di nematodi. Gli anticorpi monoclonali sviluppati da H.F. Epstein sono stati ottenuti dallo Developmental Studies Hybridoma Bank sviluppato sotto gli auspici del NICHD e mantenuto dal Dipartimento di Biologia dell'Università dell'Iowa. Questa ricerca è stata sostenuta da una sovvenzione della Israel Science Foundation (sovvenzione n. 278/18) e da una sovvenzione del Ministero israeliano della Scienza e della Tecnologia, e del Ministero degli Affari Esteri e della Cooperazione Internazionale, Direzione Generale per la Promozione del Paese, Repubblica Italiana (sovvenzione n. 3-14337). Ringraziamo i membri del laboratorio Ben-Zvi per l'aiuto nella preparazione di questo manoscritto.

1. Preparazione di piastre di crescita di nematodi per RNAi
<ol><li>In una bottiglia da 1 L aggiungere 3 g di NaCl, 2,5 g di Bacto-Peptone, 17 g di agar e acqua distillata fino a 1 L e autoclave.</li>
	<li>Raffreddare la bottiglia a 55 °C.</li>
	<li>Aggiungere 25 mL di 1 M KH2PO4,pH 6,0, 1 mL di 1 M CaCl2,1 mL di 1 M MgSO4e 1 mL di soluzione di colesterolo(Tabella 1)per produrre mezzi di crescita nematodi (NGM).</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di ampicillina (100 mg/mL) e 0,5 mL di 1 M IPTG(Tabella 1)per produrre la soluzione di NGM-RNAi. NOTA: I batteri HT115 (DE3) E. coli comunemente usati contengono una DNA polimerasi T7 inducibile da IPTG utilizzata per esprimere i plasmidi che codificano per il dsRNA. Questi plasmidi codificano anche per la resistenza all'ampicillina.</li>
	<li>Mescolare la soluzione calda facendo roteare la bottiglia.</li>
	<li>Nel cappuccio o utilizzando procedure sterili, versare la soluzione NGM in piastre o utilizzando una pompa peristaltica, erogare la soluzione in piastre. Utilizzare piastre a 6 pozzi, 12 pozzi, 40 mm o 60 mm per questo schermo. Agar dovrebbe riempire circa 2/3 della profondità della piastra.</li>
	<li>Lasciare asciugare le piastre per una notte sul banco a temperatura ambiente, mantenendo le piastre coperte. Le piastre NGM per RNAi possono essere conservate a 4 °C per un massimo di un mese.</li>
</ol>2. Crescita dei batteri RNAi e semina delle piastre
<ol><li>Nel cappuccio o utilizzando procedure sterili, aggiungere 1 mL di ampicillina (100 mg/mL) e 2,5 mL di tetraciclina (5 mg/mL) (Tabella 1) a una soluzione e miscela pre-autoclavata da 1 L di LB. NOTA: I batteri HT115 (DE3) E. coli comunemente usati sono resistenti alle tetracicline.</li>
	<li>Nel cappuccio o utilizzando procedure sterili, aggiungere 600 μL di soluzione LB a ciascun pozzo in piastre sterili da 96 pozzi profonde 2 mL. È meglio usare un pipetto multicanale per erogare il supporto.</li>
	<li>Utilizzando procedure sterili, inoculare pozzi con batteri HT115 (DE3) E. coli trasformati con un plasmide che codifica per il dsRNA che prende di mira un gene di interesse o un plasmide vuoto, come controllo. Coprire le piastre e incubare a 37 °C durante la notte. Le librerie costituite da cloni batterici che esprimono dsRNA, corrispondenti a circa il 94% dei geni previsti di C. elegans, sono state precedentemente costruite22,23 e sono disponibili in commercio. La biblioteca di accompagnatori utilizzata qui è stata costruita dal laboratorio del Dr. Richard Morimoto26.</li>
	<li>Utilizzando procedure sterili, seminare 75, 150 o 250 μL di batteri sulle piastre NGM RNAi a 12 pozzi, 40 mm e 6 o 60 mm, rispettivamente. Contrassegnare chiaramente il nome del gene bersaglio sulla piastra. I batteri dovrebbero coprire il 30-50% della superficie dell'agar e non dovrebbero toccare i bordi della piastra.</li>
	<li>Lasciare asciugare le piastre per almeno 2 giorni sul banco a temperatura ambiente, mantenendo le piastre coperte. NOTA: le piastre possono essere incubate a 37 °C durante la notte. Assicurarsi che i pozzi interni siano asciutti prima di utilizzare o conservare le piastre. Per tutti gli scopi a lungo termine (ad es. essiccazione o conservazione) tenere le piastre al buio. I piatti essiccati con semi possono essere conservati a 4 °C per un massimo di un mese.</li>
</ol>3. Sincronizzazione non stressante degli embrioni
<ol><li>Usa un worm pick per spostare circa 100 uova da una piastra worm non sincronizzata a una piastra NGM appena seminata.</li>
	<li>Coltivare animali per 5 giorni a 15 °C, 3,5 giorni a 20 °C o 2,5 giorni a 25 °C. Gli animali dovrebbero raggiungere il primo giorno di deposizione delle uova. NOTA: I vermi sono comunemente coltivati a 20 °C. Tuttavia, diversi ceppi mutanti di chaperone possono richiedere temperature di coltivazione specifiche. Ad esempio, molti ceppi sensibili alla temperatura vengono coltivati a 15 °C ma spostati a 25 °C per esporre il loro fenotipo.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di tampone M9 (Tabella 1) lentamente e lontano dal prato batterico. Ruotare la piastra in modo che il buffer copra completamente la piastra. Quindi inclinarlo da un lato e rimuovere il liquido dalla piastra e lavare gli animali dal piatto. NOTA: Quando si utilizzano animali sensibili alla temperatura o mutanti chaperone, è meglio mantenere i buffer utilizzati nel protocollo alla temperatura di coltivazione degli animali.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 3.3 tre volte o fino a quando tutti gli animali non vengono lavati via dal piatto.</li>
	<li>Usando una punta di plastica standard, tagliare un quadrato di agar dal piatto lavato dove sono concentrate le uova e posizionare il pezzo di agar su un piatto NGM appena seminato. NOTA: sono necessarie ~ 200 uova per produrre abbastanza animali che depongono le uova; troppi animali consumano i batteri troppo rapidamente. Bassi livelli di cibo possono avere un impatto sulla proteostasi27.</li>
	<li>Coltivare gli animali per 5 giorni a 15 °C, 3,5 giorni a 20 °C o 2,5 giorni a 25 °C. A questo punto, le piastre dovrebbero essere coperte con uova sincronizzate. NOTA: gli animali possono essere spostati su una nuova piastra per una breve durata per una sincronizzazione più rigorosa. Tuttavia, è importante utilizzare solo gli adulti nelle prime fasi della deposizione delle uova poiché gli animali possono trattenere le uova nel loro utero influenzando la sincronizzazione.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di tampone M9 lentamente e lontano dal prato batterico.</li>
	<li>Ruotare la piastra in modo che il buffer copra completamente la piastra. Quindi inclinarlo da un lato e rimuovere il liquido dalla piastra e lavare gli animali dal piatto.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 3.7 tre volte o fino a quando tutti gli animali non vengono lavati via dal piatto.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di tampone M9 e utilizzare un raschietto cellulare per rilasciare le uova dalla piastra.</li>
	<li>Raccogliere il tampone M9 contenente le uova dalle piastre.</li>
	<li>Centrifugare il tampone M9 contenente le uova a 3.000 x g per 2 min.</li>
	<li>Rimuovere il surnatante e aggiungere il tampone M9 per raggiungere un volume di 1 ml.</li>
	<li>Risuscindi le uova per interrompere eventuali pezzi di uova e batteri.</li>
	<li>Ripetere la procedura di lavaggio descritta nei passaggi 3.11-3.13 cinque volte. Il pellet d'uovo dovrebbe apparire bianco. Se è ancora giallo/marrone, ripetere il lavaggio fino a ottenere un pellet bianco. NOTA: i batteri che rimangono sulle uova possono contaminare i batteri che esprimono dsRNA.</li>
	<li>Rimuovere la maggior parte del surnatante, lasciando circa 200 μL. Le uova sincronizzate possono essere utilizzate per gli schermi RNAi.</li>
</ol>4. Saggi fenotipici comuni
<ol><li>Coltivazione di animali durante gli esperimenti<ol>
<li>Metti una goccia di ~ 30 uova vicino al prato batterico in ogni piatto con semi di RNAi. Per riferimento, posizionare anche ~ 30 uova su piastre seminate con batteri vuoti contenenti vettori (L4440).</li>
		<li>Coltivare animali sincronizzati con l'età su piastre con semi NGM RNAi. La durata dell'esperimento dipenderà dalla fase in cui gli animali devono essere monitorati e dalla temperatura di coltivazione. Regolare la temperatura di coltivazione quando si utilizzano animali mutanti sensibili alla temperatura. Regolare la durata della coltivazione quando si utilizzano animali mutanti ritardati nello sviluppo. NOTA: Mentre i tempi possono variare, una volta che gli animali raggiungono l'età adulta, la deposizione delle uova (e il conseguente rapido consumo di cibo), così come la proteostosi dipendente dall'età collassano28, potrebbero influire sui risultati. Si raccomanda quindi di segnare gli animali prima dell'inizio della deposizione delle uova (giorno 1 dell'età adulta). Gli animali selvatici raggiungono questo stadio dopo 4,5 giorni a 15 °C, 3 giorni a 20 °C o 2 giorni a 25 °C.</li>
		<li>Il numero di ripetizioni utilizzate dipenderà dalle dimensioni del set di geni esaminato. Per la libreria di chaperone (97 geni), ripetere gli esperimenti almeno quattro volte. La dimensione della popolazione dipende dal test utilizzato. Nei saggi comportamentali discussi qui, il punteggio >15 animali per condizione sperimentale in ogni ripetizione. Anche i dati e le analisi statistiche dipendono fortemente dal tipo di test utilizzato. I dati nei saggi discussi qui possono essere presentati come mezzi ± SEM.</li>
		<li>Confronta gli animali trattati con controllo RNAi e vettori vuoti come popolazioni indipendenti. I valori P possono essere calcolati utilizzando ANOVA unidire o bidirezionale, a seconda delle modifiche esaminate, vale a dire aggravando o alleviando da soli o entrambi. Quando si esamina un singolo trattamento RNAi rispetto al controllo, i valori P possono essere calcolati utilizzando il test della somma di rango di Mann-Whitney unidirezionale o bidirezionale. Oltre alla significatività statistica, considerare una soglia per gli hit in base al grado di impatto sul fenotipo.</li>
	</ol></li>
	<li>Arresto/ritardo dello sviluppo<ol>
<li>Coltivare animali sincronizzati con l'età come nel passaggio 4.1 fino a quando gli animali cresciuti su batteri di controllo contenenti vettori vuoti raggiungono l'età adulta, ma prima che inizi la deposizione delle uova.</li>
		<li>Monitora gli animali usando uno stereomicroscopio e conta il numero di larve e adulti per segnare la percentuale di animali ritardati nello sviluppo. Per riferimento, confronta con animali mutanti cresciuti su batteri di controllo contenenti vettori vuoti. Il trattamento con hsp-1 o hsp-90 RNAi provoca l'arresto dello sviluppo di animali selvatici e può essere utilizzato come controllo positivo.</li>
		<li>Per segnare la percentuale di animali ritardati nello sviluppo nel tempo, ripetere il passaggio 4.2.2. NOTA: Se ci sono adulti che depongono le uova sulla piastra, trasferire gli animali ritardati nello sviluppo in una nuova piastra NGM-RNAi etichettata per lo stesso gene bersaglio per evitare confusione con la progenie.</li>
	</ol></li>
	<li>Sterilità o difetti di deposizione delle uova<ol>
<li>Coltiva animali sincronizzati con l'età come nel passaggio 4.1 fino a quando gli animali cresciuti su batteri vuoti di controllo vettoriale iniziano a deportare le uova.</li>
		<li>Monitora gli animali usando uno stereomicroscopio e segna la percentuale di animali senza uova visibili nel loro utero. Per riferimento, confronta con animali mutanti cresciuti su batteri vuoti di controllo vettoriale.</li>
		<li>In alternativa, monitorare gli animali utilizzando uno stereomicroscopio e segnare la percentuale di animali con un utero pieno di uova, definito come EGg Laying defective (Egl-d) fenotipo29.</li>
	</ol></li>
	<li>Letalità embrionale<ol>
<li>Coltiva animali sincronizzati con l'età come nel passaggio 4.1 fino a quando gli animali iniziano a deportare le uova.</li>
		<li>Trasferire ~ 100 uova in un piatto vuoto. Distribuire le uova in file per semplificare il conteggio.</li>
		<li>Segna la percentuale di uova non schifate sul piatto dopo 24-48 ore. Per riferimento, confrontare con uova di animali trattati con batteri vuoti di controllo del vettore.</li>
	</ol></li>
	<li>Test di paralisi<ol>
<li>Per gli adulti del giorno 1, coltiva animali sincronizzati con l'età come nel passaggio 4.1 fino a quando gli animali cresciuti su batteri vuoti di controllo del vettore raggiungono l'età adulta, ma prima che inizi la deposizione delle uova.</li>
		<li>Disegna una linea sul retro di una normale piastra di agar NGM usando un pennarello fine.</li>
		<li>Posiziona 5-10 animali sulla linea segnata.</li>
		<li>Imposta un timer e attendi 10 minuti.</li>
		<li>Segna la percentuale di animali rimasti sulla linea come vermi paralizzati. Per riferimento, confronta con animali mutanti cresciuti su batteri vuoti di controllo vettoriale. Gli animali selvatici trattati con unc-45 RNAi mostrano fenotipo di paralisi grave e possono essere usati come controllo positivo. NOTA: Questo test evidenzia gli animali che mostrano paralisi da media a grave. Tali animali di solito giacciono dritti sul piatto, piuttosto che presentare la forma curva comune. Inoltre, una macchia ripulita dai batteri è visibile intorno alle teste dei vermi paralizzati.</li>
	</ol></li>
	<li>Test di thrashing<ol>
<li>Coltivare animali sincronizzati con l'età come nel passaggio 4.1 fino a quando gli animali cresciuti su batteri vuoti di controllo del vettore raggiungono l'età adulta, ma prima che inizi la deposizione delle uova.</li>
		<li>Pipettare 100 μL di tampone M9 alla temperatura di coltivazione degli animali in una piastra a 96 pozzetti.</li>
		<li>Posizionare ~ 15 vermi, uno per pozzo, nei pozzi contenenti tampone M9.</li>
		<li>Lasciare che gli animali si adattino per 5 minuti.</li>
		<li>Esamina ogni animale sotto lo stereomicroscopio, avvia un timer che conta 15 s e conta il numero di curve del corpo che ogni animale esegue in quel lasso di tempo. I valori contati possono essere normalizzati in curve del corpo al minuto. Per riferimento, confronta con animali mutanti cresciuti su batteri vuoti di controllo vettoriale. NOTA: Questo test di motilità è molto sensibile e può rilevare differenze molto lievi tra i trattamenti. Tuttavia, la motilità nel liquido e la motilità sull'agar possono differire.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Validazione del knockdown proteico
<ol><li>Posizionare 250-300 uova sincronizzate su una piastra NGM-RNAi da 60 mm seminata con i relativi batteri che esprimono dsRNA o contenenti vettori vuoti (L4440). NOTA: l'abbattimento dell'RNAi potrebbe comportare un accumulo aberrante di embrioni, una mancanza di embrioni o un arresto dello sviluppo che potrebbe influire sull'espressione genica. Questo dovrebbe essere considerato quando si determina l'età degli animali da esaminare.</li>
	<li>Per gli adulti del giorno 1, coltivare animali per 4,5 giorni a 15 °C, 3 giorni a 20 °C o 2 giorni a 25 °C.</li>
	<li>Raccogliere e trasferire un totale di 200 giovani animali adulti nel cappuccio di un riempimento del tubo da 1,5 ml con 200 μL di PBS-T. NOTA: Quando si utilizzano animali sensibili alla temperatura o mutanti chaperone, è meglio mantenere i buffer utilizzati nel protocollo alla temperatura di coltivazione degli animali.</li>
	<li>Chiudere il tappo con attenzione e centrifugare a 1.000 x g per 1 minuto.</li>
	<li>Aggiungere 800 μL di PBS-T (Tabella 1) e centrifugare a 1.000 x g per 1 min.</li>
	<li>Rimuovere con attenzione i primi 900 μL.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 5.4-5.6 tre volte.</li>
	<li>Rimuovere 900 μL, lasciando 100 μL di soluzione contenente i 200 vermi.</li>
	<li>Aggiungere 25 μL di 5x buffer campione (Tabella 1).</li>
	<li>Riscaldare i campioni per 10 minuti a 92°C agitando a 1000 giri/min. I campioni possono quindi essere congelati e conservati a -20 °C.</li>
	<li>Caricare 20 μL di ciascun campione ed eseguire su un gel SDS-PAGE.</li>
	<li>Eseguire l'analisi western blot utilizzando anticorpi appropriati per determinare la stabilità relativa della proteina.</li>
	<li>Determinare l'intensità delle bande utilizzando un software densitometrico, come il modulo gel ImageJ disponibile gratuitamente. Normalizzare tutti i valori a quelli misurati nei campioni di controllo. NOTA: Lo scopo del knockdown RNAi nei nostri schermi è quello di abbassare i livelli proteici di uno specifico chaperone / co-chaperone. Pertanto, il modo migliore per valutare l'efficienza del knockdown RNAi è l'analisi western blot. Ciò richiede anticorpi specifici. In alternativa, la qPCR può essere utilizzata per quantificare i livelli di mRNA.</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Rimane carente un quadro integrato della rete di proteostasi che rifletta come è organizzata e funziona in diverse cellule e tessuti metazoici. Per affrontare questa carenza, sono necessarie informazioni specifiche sulle interazioni di vari componenti di questa rete, come gli accompagnatori molecolari, in tessuti specifici durante il corso dello sviluppo e dell'invecchiamento. Qui, abbiamo mostrato come l'uso di perturbazioni tessuto-specifiche ci ha permesso di esaminare la rete di chaperone in un determinato tessuto. ...

Le cellule affrontano il danno proteico impiegando macchinari di controllo qualità che riparano, sequestrano o rimuovono eventuali proteine danneggiate1,2. Il ripiegamento e l'assemblaggio di complessi proteici sono supportati da chaperoni molecolari, un gruppo eterogeneo di proteine altamente conservate che possono riparare o sequestrare le proteine danneggiate3,4,5,6,7. La rimozione delle proteine danneggiate è mediata dal sistema ubiquitina-proteasoma (UPS)8 o dal macchinario autofagico9 in collaborazione con gli accompagnatori10,11,12. L'omeostasi proteica (proteostasi) è, quindi, mantenuta da reti di controllo qualità composte da macchinari di piegatura e degradazione3,13. Tuttavia, comprendere le interazioni tra i vari componenti della rete di proteostasi in vivo è una sfida importante. Mentre gli schermi di interazione proteina-proteina contribuiscono con informazioni importanti sulle interazioni fisiche e sui complessi di chaperone14,15, manca la comprensione dell'organizzazione e dei meccanismi compensatori all'interno delle reti di chaperone tessuto-specifiche in vivo.
Le interazioni genetiche sono spesso utilizzate come un potente strumento per esaminare la relazione tra coppie di geni che sono coinvolti in percorsi biologici comuni o compensatori16,17,18. Tali relazioni possono essere misurate combinando coppie di mutazioni e quantificando l'impatto di una mutazione in un gene sulla gravità fenotipica causata da una mutazione nel secondo gene16. Mentre la maggior parte di tali combinazioni non mostra alcun effetto in termini di fenotipo, alcune interazioni genetiche possono aggravare o alleviare la gravità del fenotipo misurato. Mutazioni aggravanti si osservano quando il fenotipo del mutante a doppia delezione è più grave del fenotipo atteso visto combinando i mutanti a delezione singola, il che implica che i due geni funzionano in percorsi paralleli, influenzando insieme una data funzione. Al contrario, le mutazioni attenuanti si osservano quando il fenotipo del mutante a doppia delezione è meno grave del fenotipo osservato con i mutanti a delezione singola, il che implica che i due geni agiscono insieme come un complesso o partecipano alla stessa via16,18. Di conseguenza, diversi fenotipi che possono essere quantificati, compresi fenotipi ampi, come letalità, tassi di crescita e dimensioni della covata, nonché fenotipi specifici, come i reporter trascrizionali, sono stati utilizzati per identificare le interazioni genetiche. Ad esempio, Jonikas et al. si sono affidati a un reporter dello stress ER per esaminare le interazioni della rete di proteostasi della risposta proteica dispiegata saccharomyces cerevisiae ER utilizzando analisi di delezione genica a coppie19.
Gli screening di interazione genetica comportano l'incrocio sistematico di mutazioni di delezione a coppie per generare un set completo di doppi mutanti20. Tuttavia, nei modelli animali, e in particolare in C. elegans, questo approccio su larga scala non è fattibile. Invece, i ceppi mutanti possono essere testati per i loro modelli di interazione genetica regolando l'espressione genica utilizzando l'interferenza dell'RNA (RNAi)21. C. elegans è un potente sistema per schermi basato su RNAi22,23. In C. elegans, la consegna di RNA a doppio filamento (dsRNA) è ottenuta mediante alimentazione batterica, portando alla diffusione di molecole di dsRNA a numerosi tessuti. In questo modo, le molecole di dsRNA introdotte hanno un impatto sull'animale attraverso una procedura rapida e semplice21. Uno screening di interazione genetica che utilizza RNAi può, quindi, rivelare l'impatto della down-regolazione di un insieme di geni o della maggior parte dei geni codificanti C. elegans utilizzando le librerie RNAi24. In tale schermo, i colpi che influenzano il comportamento del mutante di interesse ma non il ceppo wild type sono potenziali modificatori del fenotipo monitorato25. Qui, applichiamo una combinazione di mutazioni e screening RNAi per mappare sistematicamente le interazioni chaperone tessuto-specifiche in C. elegans.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well-plates</td>
			<td>SPL</td>
			<td>BA3D16B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mm plates</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>627160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm plates</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>628102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well 2 mL 128.0/85mm</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>780278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>AGA03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>69-52-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BO126-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02382.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td>q30548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0433-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SCGPUO2RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ165FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Frutarom</td>
			<td>2355519000024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>367-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04873.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>001649029100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22189-08-8</td>
			<td>Gift from the Morimoto laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin MHC A (MYO-3) antibody</td>
			<td>Hybridoma Bank</td>
			<td>5-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;7H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>s-0751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>001903029100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>61930705001730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate pouring pump</td>
			<td>Integra</td>
			<td>does it p920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAi Chaperone library</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>0837-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#223;-mercaptoethanol</td>
			<td>Bio world</td>
			<td>41300000-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>64-75-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>002009239100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using caenorhabditis elegans to screen for tissue-specific chaperone interactions

Il corretto ripiegamento e assemblaggio di proteine e complessi proteici sono essenziali per la funzione cellulare. Le cellule impiegano percorsi di controllo della qualità che correggono, sequestrano o eliminano le proteine danneggiate per mantenere un proteoma sano, garantendo così la proteostasi cellulare e prevenendo ulteriori danni alle proteine. A causa delle funzioni ridondanti all'interno della rete di proteostasi, lo screening per fenotipi rilevabili utilizzando knockdown o mutazioni in geni chaperone-encoding nell'organismo multicellulare Caenorhabditis elegans porta alla rilevazione di fenotipi minori o nulli nella maggior parte dei casi. Abbiamo sviluppato una strategia di screening mirata per identificare gli accompagnatori necessari per una funzione specifica e quindi colmare il divario tra fenotipo e funzione. In particolare, monitoriamo nuove interazioni chaperone utilizzando schermi di interazione sintetica RNAi, abbattendo l'espressione dell'accompagnatore, un accompagnatore alla volta, in animali portatori di una mutazione in un gene che codifica per l'accompagnatore o sovraesprimendo un accompagnatore di interesse. Interrompendo due chaperoni che individualmente non presentano fenotipo grossolano, possiamo identificare chaperoni che aggravano o espongono un fenotipo specifico quando entrambi sono perturbati. Dimostriamo che questo approccio può identificare insiemi specifici di chaperoni che funzionano insieme per modulare il ripiegamento di una proteina o di complessi proteici associati a un dato fenotipo.

Utilizzo di mutazioni sensibili alla temperatura in UNC-45 per lo screening delle interazioni aggravanti o attenuanti in condizioni permissive o restrittive, rispettivamente L'assemblaggio e la manutenzione muscolare offrono un sistema efficace per studiare le interazioni chaperone tessuto-specifiche. L'unità funzionale dei muscoli contrattili, il sarcomero, presenta una disposizione cristallina di proteine strutturali e regolatrici. La stabilità della proteina motoria miosina e la sua incorporazion...

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Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Per studiare le interazioni chaperone-chaperone e chaperone-substrato, eseguiamo screening di interazione sintetica in Caenorhabditis elegans utilizzando l'interferenza dell'RNA in combinazione con mutazioni lievi o sovraespressione di chaperoni e monitoriamo la disfunzione proteica tessuto-specifica a livello di organismo.

Utilizzo di Caenorhabditis elegans per lo screening delle interazioni chaperone tessuto-specifiche

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...

using-caenorhabditis-elegans-to-screen-for-tissue-specific-chaperone

Research

JoVE Journal

Biology

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

2.8K Views.  Ben-Gurion University of the Negev. Per studiare le interazioni chaperone-chaperone e chaperone-substrato, eseguiamo screening di interazione sintetica in Caenorhabditis elegans utilizzando l'interferenza dell'RNA in combinazione con mutazioni lievi o sovraespressione di chaperoni e monitoriamo la disfunzione proteica tessuto-specifica a livello di organismo.

Video: Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Di base<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Metodi: sincronizzazione e di osservazione

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Ricerca

Biologia

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

Utilizzo di RNA-mediata strategia di alimentazione di interferenza secondo schermo per geni coinvolti nella regolazione Dimensione del corpo nel nematode<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, and participate in various signaling pathways. Caenorhabditis elegans synthesizes all of the enzymes necessary to produce a range of omega-6 and omega-3 fatty acids. This, combined with the simple anatomy and range of available genetic tools, make it an attractive model to study fatty acid function. In order to investigate the genetic pathways that mediate the physiological effects of dietary fatty acids, we have developed a method to supplement the C. elegans diet with unsaturated fatty acids. Supplementation is an effective means to alter the fatty acid composition of worms and can also be used to rescue defects in fatty acid-deficient mutants. Our method uses nematode growth medium agar (NGM) supplemented with fatty acidsodium salts. The fatty acids in the supplemented plates become incorporated into the membranes of the bacterial food source, which is then taken up by the C. elegans that feed on the supplemented bacteria. We also describe a gas chromatography protocol to monitor the changes in fatty acid composition that occur in supplemented worms. This is an efficient way to supplement the diets of both large and small populations of C. elegans, allowing for a range of applications for this method.

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a useful model to explore the functions of polyunsaturated fatty acids in development and physiology. This protocol describes an efficient method of supplementing the C. elegans diet with polyunsaturated fatty acids.

La supplementazione alimentare di acidi grassi polinsaturi a<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, ...

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode&#8217;s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.

Un Screenable<em&gt; In Vivo</em&gt; Saggio per mitocondriale modulatori Uso Transgenic Bioluminescent<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These age-associated disorders are characterized by the appearance of protein aggregates with fibrillary structure in the brains of these patients. Exactly why normally soluble proteins undergo an aggregation process remains poorly understood. The discovery that protein aggregation is not limited to disease processes and instead part of the normal aging process enables the study of the molecular and cellular mechanisms that regulate protein aggregation, without using ectopically expressed human disease-associated proteins. Here we describe methodologies to examine inherent protein aggregation in Caenorhabditis elegans through complementary approaches. First, we examine how to grow large numbers of age-synchronized C. elegans to obtain aged animals and we present the biochemical procedures to isolate highly-insoluble-large aggregates. In combination with a targeted genetic knockdown, it is possible to dissect the role of a gene of interest in promoting or preventing age-dependent protein aggregation by using either a comprehensive analysis with quantitative mass spectrometry or a candidate-based analysis with antibodies. These findings are then confirmed by in vivo analysis with transgenic animals expressing fluorescent-tagged aggregation-prone proteins. These methods should help clarify why certain proteins are prone to aggregate with age and ultimately how to keep these proteins fully functional.

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

The goal of the method presented here is to explore protein aggregation during normal aging in the model organism C. elegans. The protocol represents a powerful tool to study the highly insoluble large aggregates that form with age and to determine how changes in proteostasis impact protein aggregation.

Metodi di studio variazioni inerenti l'aggregazione proteica con l'età in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a growing number of age-associated diseases. For instance, proteins with polyglutamine expansions are prone to aggregation, as exemplified with the huntingtin protein and concomitant onset of Huntington&#8217;s disease. The age-associated deterioration of the proteome has been widely studied through the use of transgenic Caenorhabditis elegans expressing polyQ repeats fused to a yellow fluorescent protein (YFP). This polyQ::YFP transgenic animal model facilitates the direct quantification of the age-associated decline of the proteome through imaging the progressive formation of fluorescent foci (i.e., protein aggregates) and subsequent onset of locomotion defects that develop as a result of the collapse of the proteome. Further, the expression of the polyQ::YFP transgene can be driven by tissue-specific promoters, allowing the assessment of proteostasis across tissues in the context of an intact multicellular organism. This model is highly amenable to genetic analysis, thus providing an approach to quantify aging that is complementary to lifespan assays. We describe how to accurately measure polyQ::YFP foci formation within either neurons or body wall muscle during aging, and the subsequent onset of behavioral defects. Next, we highlight how these approaches can be adapted for higher throughput, and potential future applications using other emerging strategies for C. elegans genetic analysis.

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Proteostatic decline is a hallmark of aging, facilitating the onset of neurodegenerative diseases. We outline a protocol to quantifiably measure proteostasis in two different Caenorhabditis elegans tissues through heterologous expression of polyglutamine repeats fused to a fluorescent reporter. This model allows rapid in vivo genetic analysis of proteostasis.

Quantificazione del declino proteostatico tessuto-specifico nella Caenorhabditis elegans

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their detrimental effects on the human life quality and the healthcare system, the majority of human neurodegenerative disorders still remain incurable and non-preventable. Therefore, the development of novel therapeutic interventions against such maladies is becoming a pressing urgency. Age-associated deterioration of neuronal circuits and function is evolutionarily conserved in organisms as diverse as the lowly worm Caenorhabditis elegans and humans, signifying similarities in the underlying cellular and molecular mechanisms. C. elegans is a highly malleable genetic model, which offers a well-characterized nervous system, body transparency and a diverse repertoire of genetic and imaging techniques to assess neuronal activity and quality control during ageing. Here, we introduce and describe methodologies utilizing some versatile nematode models, including hyperactivated ion channel-induced necrosis (e.g., deg-3(d) and mec-4(d)) and protein aggregate (e.g., &#945;-syunclein and poly-glutamate)-induced neurotoxicity, to monitor and dissect the cellular and molecular underpinnings of age-related neuronal breakdown. A combination of these animal neurodegeneration models, together with genetic and pharmacological screens for cell death modulators will lead to an unprecedented understanding of age-related breakdown of neuronal function and will provide critical insights with broad relevance to human health and quality of life.

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Here, we introduce and describe widely accessible methodologies utilizing some versatile nematode models, including hyperactivated ion channel-induced necrosis and protein aggregate-induced neurotoxicity, to monitor and dissect the cellular and molecular underpinnings of age-associated neurodegenerative diseases.

Modellazione di malattie neurodegenerative associate all'età in Caenorhabditis elegans

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their ...

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

The nematode Caenorhabditis elegans is a model system for host-microbe and host-microbiome interactions. Many studies to date use batch digests rather than individual worm samples to quantify bacterial load in this organism. Here it is argued that the large inter-individual variability seen in bacterial colonization of the C. elegans intestine is informative, and that batch digest methods discard information that is important for accurate comparison across conditions. As describing the variation inherent to these samples requires large numbers of individuals, a convenient 96-well plate protocol for disruption and colony plating of individual worms is established.

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

This protocol describes a 96-well disruption of individual bacterially colonized Caenorhabditis elegans following cold paralysis and surface bleaching&#160;to remove external bacteria. The resulting suspension is plated on agar plates to allow accurate, medium-throughput quantification of bacterial load in large numbers of individual worms.

Utilizzo di dati single-worm per quantificare l'eterogeneità nelle interazioni caenorhabditis elegans-batteriche

The nematode Caenorhabditis elegans is a model system for host-microbe and host-microbiome interactions. Many studies to date use batch digests rather ...

Quantificazione della mitofagia in C. elegans e in una linea cellulare di cancro al fegato

Detection of Mitophagy in Caenorhabditis elegans and Mammalian Cells Using Organelle-Specific Dyes

Mitochondria are essential for various biological functions, including energy production, lipid metabolism, calcium homeostasis, heme biosynthesis, regulated cell death, and the generation of reactive oxygen species (ROS). ROS are vital for key biological processes. However, when uncontrolled, they can lead to oxidative injury, including mitochondrial damage. Damaged mitochondria release more ROS, thereby intensifying cellular injury and the disease state. A homeostatic process named mitochondrial autophagy (mitophagy) selectively removes damaged mitochondria, which are then replaced by new ones. There are multiple mitophagy pathways, with the common endpoint being the breakdown of the damaged mitochondria in lysosomes. 
Several methodologies, including genetic sensors, antibody immunofluorescence, and electron microscopy, use this endpoint to quantify mitophagy. Each method for examining mitophagy has its advantages, such as specific tissue/cell targeting (with genetic sensors) and great detail (with electron microscopy). However, these methods often require expensive resources, trained personnel, and a lengthy preparation time before the actual experiment, such as for creating transgenic animals. Here, we present a cost-effective alternative for measuring mitophagy using commercially available fluorescent dyes targeting mitochondria and lysosomes. This method effectively measures mitophagy in the nematode Caenorhabditis elegans and human liver cells, which indicates its potential efficiency in other model systems.

Autore in primo piano: Rilevamento della mitofagia in Caenorhabditis elegans e cellule di mammifero utilizzando coloranti specifici per organelli  

Exploring mitophagy through electron microscopy, genetic sensors, and immunofluorescence requires costly equipment, skilled personnel, and a significant time investment. Here, we demonstrate the efficacy of a commercial fluorescence dye kit in quantifying the mitophagy process in both Caenorhabditis elegans and a liver cancer cell line.

Rilevazione della mitofagia in Caenorhabditis elegans e cellule di mammifero utilizzando coloranti organelli-specifici

Mitochondria are essential for various biological functions, including energy production, lipid metabolism, calcium homeostasis, heme biosynthesis, ...