因此，当我们评估新的抗感染药物时，我们必须解决两件事。一边是细菌。如果它们是浮游生物膜或知情生物膜，另一边是宿主细胞的存在，特别是上皮宿主细胞，它们形成紧密的生物屏障。
如果这些障碍生效，怪物反应可能如何，并且有了这个新模型，我们实际上可以同时监视这两个参数。在治疗细菌感染时，我们必须意识到什么器官受到影响。例如，如果是肺，我们可以利用，并顶做药物作为气溶胶。
然而，如果我们想要一个模型来研究这个问题，我们需要一个模型，也允许气溶胶的位置，这是我们的模型。另一个优点是它基于人类细胞，这样我们就可以避免由于动物和物种差异而导致的问题。该系统可以让您更深入地了解感染研究领域，在宿主细胞和细菌的相互作用过程中揭示分子和细胞事件。
首次尝试此协议时，请记住检查细胞培养基的不育性和细胞形态，在处理可渗透支架时要小心。在含有10%FCS、1%非必需氨基酸和每升600毫克葡萄糖的T 75烧瓶中培养CFBE41 O减细胞，含5%二氧化碳。每两到三天向细胞中加入一次新鲜介质。
细胞达到70%的汇合后，用10毫升PBS清洗，并在37摄氏度下分离3毫升的尝试性EDTA，15分钟。然后，加入7毫升新鲜MM，将细胞在300倍G下离心4分钟。丢弃上清液后，在 10 毫升的 MEM，同时用温和的移液扰乱团块。
使用自动细胞计数器或血细胞计室对细胞进行计数，然后稀释到每500微升20万个细胞的浓度，用于在12个带渗透支架的井板中播种。将每井的细胞悬浮液加入 500 微升，用于渗透支撑的阴面。然后向基底侧添加1.5毫升新鲜介质。
在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育细胞72小时。在播种后的第三天，先从基础侧侧去除介质，然后从水平侧移除介质，从而创建空气液体界面。在基底侧侧加入500微升新鲜 MEM，并每隔两天更换介质，直到细胞形成汇合单层。
要评估细胞的上皮屏障特性，将500微升细胞培养基添加到细胞侧，向基底侧添加1.5毫升，然后将板返回培养箱一小时。使用 AN STX2 筷子电极和上皮伏欧姆表测量运输材料电阻或 TEER。为了培养THP1细胞，使用RMMI 1640基基在T 75烧瓶中生长，在37摄氏度和5%的二氧化碳下辅以10%FCS。
每两天在一个新的T75烧瓶中播种200万个细胞，每天分裂细胞。为了区分THP1细胞，将烧瓶中300倍G的内端物离心4分钟，丢弃上一代。将颗粒重新放入新鲜介质中，放入新的 T75 烧瓶中。
每毫升PMA向细胞中加入10毫微克，然后返回培养箱。要像细胞一样分离巨噬细胞，在37摄氏度下用PBS清洗一次，并在室温下用含有0.5毫摩尔EDTA的三毫升细胞分离溶液孵育10分钟。在倒置显微镜下检查细胞分离。
当细胞分离后，加入7毫升新鲜介质，并在300倍G下离心4分钟。取出上清液后，在15毫升锥形管中将巨噬细胞重新在THP1培养基的三毫升中，数数细胞，并在建立共培养之前孵育最多一小时。要建立上皮巨噬细胞共培养，请从 CFBE41 O 减去单层的下腔中去除介质，并小心地反转无菌玻璃培养皿内的支撑，使用细胞刮刀去除通过膜孔隙过度生长的细胞。
将 200，000 个 THP1 巨噬细胞放在每个井中倒置刀片的基底侧侧 200 微升 RPMI 中，关闭培养皿，并孵育两小时。然后将刀片放回 12 孔微板中，并将 500 微升 MEM 介质添加到可渗透刀片的基底侧侧。接种15毫升磅，每毫升氨基林补充300微克，用PAO1GFP的单一聚落P aeruginosa，在37摄氏度下孵育18小时，同时在180RPM下颤抖。
孵育后，将细菌转移到50毫升锥形管中，并在3，850次G下离心机进行5分钟。丢弃上一杯，加入10毫升的无菌PBS，这些 PBS 已预热至 37 摄氏度。以600纳米测量光学密度，将细胞培养的细菌浓度调整为每毫升20万个菌落形成单位的最终浓度，这相当于每个上皮细胞感染一个细菌的多样性。
将100微升的细菌悬浮液加入渗透支撑的阴膜侧，在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育一小时，让细菌附着在细胞上，然后用移液器小心地去除脂肪液体，以恢复ALI条件。对于药物治疗的实验，将500微升的药物溶液稀释在细胞培养的细胞侧。然后向基底侧添加1.5毫升细胞培养基。
收集500微升的非典型和基底侧向介质，并汇集它们来评估非附着细菌的CFU。为了评估附着细菌或内化细菌的存活率，在渗透支撑的每个隔间中加入500微升无菌去越冷水，并在室温下孵育细胞30分钟。如果从冷冻样品中评估CFU，在37摄氏度下解冻10分钟。
然后使用移液器尖端刮膜表面，注意不要给油井施加太大的压力。上下移位删除所有粘附的内容。与两个分数的细菌悬浮液，使一到10连续稀释与PBS补间和板细菌在磅加糖板。
在30摄氏度下孵育的麦格板16至72小时，然后计算菌落并计算CFU。此处显示了人类支气管上皮细胞和巨噬细胞在渗透支架的渗透侧和罗勒侧产生的共培养的形态。对于紧密结点蛋白ZO1，更高的TEER测量和免疫保持，证明了上皮屏障的完整性。
为了模拟细菌感染，P aeruginosa在CFBE41 o减细胞上接种。在感染后6小时，在共培养体的一侧观察到巨噬细胞。TEER 下降到每厘米 250 欧姆平方，表明上皮屏障受损，ZO1 染色也暗示了这一点。
微噬细胞通过可渗透的过滤孔和细菌吸收的THP-1细胞在脂肪侧移动迁移显示在这里。在THP-1单培养中，巨噬细胞早在感染后一小时就迁移。同时，在共同培养的感染后三小时后，也可以看到这种迁移。
使用托布拉霉素治疗6或20小时的感染共培养物被用共声扫描激光显微镜成像。如果不进行治疗，上皮细胞或巨噬细胞在感染20小时后死亡。尽管在显微镜图片中进行了六个小时的治疗后，CFU的测定表明细菌并没有扩散。
然而，经过20小时的治疗，细菌恢复了其增殖能力。还对单一文化和共同文化的TEER进行测量。与单一培养相比，CFBE41 o减去THP-1细胞的共培养并没有引起上皮屏障完整性的任何变化。
感染后，TEER 值下降。执行此过程时，确保细胞正确安装且滤膜不被破坏至关重要。因此，需要仔细执行细胞播种步骤。
除了这个协议，插入物上的抗生素雾化将有可能看到细菌的生存是否变化相比，淹没的条件。
