HDM过敏原中免疫原RNA物种的识别和特征，可调节嗜酸性肺炎

该协议旨在解决一个非常重要和未解决的问题，微生物物质存在和环境过敏原如何可以调节过敏性炎症的发展。具体来说，这里介绍的方法可以帮助回答家庭尘虫中的双链RNA物种是否在体内具有免疫原性，并能够调节嗜酸性肺炎症。这些技术的主要优点是简单、高效、可重复性高，可以使用常用的工具和设备执行。

这些方法还可用于评估由呼吸道病毒感染引起的肺部疾病。李女士，我实验室的研究生，将帮助演示这个程序。首先从过敏原、昆虫和非昆虫过敏原中隔离总RNA。

将适当数量的试样转移到含有1.4毫米陶瓷珠的两毫升管中，并在液氮容器中冷冻约10分钟。在每个管中加入一毫升的硫化铀基RNA分离试剂。然后用高能细胞干扰器以最高速度打破昆虫和非昆虫小动物45秒。

在冰上冷却样品，然后重复此过程两次。将溶液转移到新的 1.5 毫升管中。在每个管中加入200微升氯仿，并旋转样品。

在4摄氏度下以14，000次g离心14分钟。然后将上水相转移到含有500微升异丙醇的新管中。混合样品。

然后在摄氏4度下以14，000次g离心14分钟。小心吸上一道。然后用 500 微升 75%乙醇清洗 RNA 颗粒，并在 4 摄氏度下以 7，500 次 g 离心，10 分钟。

小心地去除所有液体。空气干燥颗粒，用20至50微升无RNase水溶解RNA。为了检测总RNA中的双链RNA结构，将每微升200纳米RNA样本的两微升检测到带正素的尼龙膜上。

在UV交联器中，将样品以1200微焦耳和100微焦耳将样品交联到膜上。重复发现和交联两次，这将导致每印1.2微克RNA。在室温下摇动时，在 TBS-T 中与 5% 牛奶进行非特异性结合一小时。

然后去除阻断溶液，在TBS-T中以1至1000%的稀释剂加入抗双链RNA J2抗体。在摄氏四度下孵育膜过夜。第二天，用TBS-T清洗膜三次，每次洗涤五分钟。

加入二次抗体，在室温下孵育膜一小时。然后用 TBS-T 重复洗涤。加入基板，孵育膜5至15分钟，直到所需信号可见。

用双蒸馏水冲洗膜，停止反应。要收集肺样本，请将肺放在纸巾上，并切除每个肺叶的一小块。将每块放入含有珠子的两毫升管中。

要收集支气管，用70%乙醇对安乐死小鼠进行消毒，并使用剪刀将皮肤从腹部的上部区域切到颈部。用钳子轻轻拉开唾液腺和胸腺肌肉，露出气管。然后在它下面放置一根尼龙绳。

在气管下切开大约两毫升，刚好足以插入一个管，并打结气管和气管周围的字符串。将注射器连接到管的端，然后用新鲜的 PBS-EDTA 将其加载。然后将溶液的一毫升注射并吸入肺部。

将注射器从管子上分离，然后将溶液喷射到 15 毫升管中。使用新鲜的 PBS-EDTA 将此过程重复到冰中，然后将熔岩池池。在4摄氏度下以500倍g离心管7分钟。

然后记录体积，然后将上流液转移到两个1.5毫升管，而不会干扰颗粒。重新暂停颗粒后，将 150 微升转移到 96 井板中，并在 500 倍 g 和 4 摄氏度下离心板 7 分钟。然后快速反转纸巾上的盘子，取出上一除。

在2.4G2阻断抗体的情况下，用抗体在FACS缓冲液中染色细胞，并在室温下在黑暗中孵育板30分钟。染色后，将板离心，在4摄氏度下以500倍g的分粒7分钟。将板倒置在纸巾上，去除染色溶液。

添加 100 微升的 FACS 缓冲液洗涤细胞，然后重复离心。将样品重新填充在 150 微升的 FACS 缓冲液中，然后将它们传输到包含另外 350 微升缓冲液的 FACS 管中。在每个样品中加入25微升的计数珠，然后进行流式细胞测量分析。

使用双链、RNA特异性小鼠单克隆抗体，用点印来检查家庭尘虫、昆虫和非昆虫小动物中长双链RNA结构的存在。RNase III 用于将双链 RNA 消化成 12 到 15 个基对片段，J2 无法检测到这些片段。RT-qPCR证明了家尘虫总RNA刺激小鼠肺部先天免疫反应的能力。RNase III 治疗废除了家庭尘虫总 RNA 的免疫刺激活性，表明双链 RNA 结构对肺部的先天免疫活动至关重要。

通过FACS分析，评价了家尘虫总RNA对严重二型肺炎症发育的抑制作用。嗜酸性肺炎是由尘虫提取物引起的，这些提取物使用或没有RNase III进行治疗。长双链RNA物种的降解导致严重的二型肺炎症，这反映在支气管和肺部的嗜酸性果蝇数量增加。

值得注意的是，经过尘虫总RNA处理的组的嗜酸性蛋白患者数量与使用原尘虫提取物处理的组相当，该组内源性地含有长双链RNA物种。尝试此协议时，在注射和回忆 BAL 液体时要非常小心，因为在此阶段对肺部的任何损害都可能会改变最终结果。除此程序外，还可以执行其他方法（如 ELISA）来分析 BAL 流体中存在的非细胞溶性物质。

开发后，该技术为研究人员探索环境过敏原中其他微生物物质铺平了道路，例如可调节过敏性肺炎症发育的非双链RNA因子。