פרוטוקול זה נועד לטפל בנושא חשוב מאוד ולא פתור על איך חומרים מיקרוביאליים נוכחים ואלרגנים סביבתיים יכולים לווסת את הפיתוח של דלקת אלרגית. באופן ספציפי, השיטות המוצגות כאן יכולות לעזור לענות אם מינים RNA דו-נטושים בקרדית אבק הבית הם אימונוגניים ב- vivo ומצליחים לווסת דלקת ריאות אאוזינופילית. היתרונות העיקריים של טכניקות אלה הם שהם פשוטים, יעילים, ניתנים לשחזור גבוה ו ניתן לבצע אותם באמצעות כלים וציוד נפוצים.
שיטות אלה יכולות לשמש גם כדי להעריך מחלות ריאות הנגרמות על ידי זיהומים ויראליים בדרכי הנשימה. לי היא, סטודנטית לתואר שני במעבדה שלי, תעזור להדגים את ההליך. התחל על ידי בידוד RNA הכולל של אלרגנים, חרקים, ואלרגנים שאינם חרקים.
מעבירים כמות נאותה של דגימה לתוך צינור שני מיליליטר המכיל 1.4 מילימטרים של חרוזים קרמיים, ולהקפיא את הצינורות במיכל חנקן נוזלי במשך כ 10 דקות. הוסף מיליליטר אחד של ריאגנט בידוד RNA מבוסס guanidinium thiocyanate לכל צינור. ואז לשבור את החרק ובעלי חיים קטנים שאינם חרקים עם משבש תאים באנרגיה גבוהה במהירות המרבית במשך 45 שניות.
מצננים את הדגימה על הקרח, וחוזרים על תהליך זה פעמיים. העבר את הפתרון לצינור חדש של 1.5 מיליליטר. הוסף 200 מיקרוליטרים של כלורופורם לכל צינור, ומערבולת המדגם.
צנטריפוגה הצינורות ב 14, 000 פעמים גרם במשך 14 דקות בארבע מעלות צלזיוס. ואז להעביר את השלב הממימי העליון לתוך צינור חדש המכיל 500 microliters של isopropanol. מערבבים את הדגימה.
ואז צנטריפוגה זה ב 14, 000 פעמים גרם במשך 14 דקות בארבע מעלות צלזיוס. בזהירות שאף את העל-טבעי. לאחר מכן לשטוף את גלולת RNA עם 500 microliters של 75% אתנול, צנטריפוגה אותו ב 7, 500 פעמים גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
בזהירות להסיר את כל הנוזלים. לייבש את הכדור באוויר, ולהמיס את RNA עם 20 עד 50 microliters של מים ללא RNase. כדי לזהות את מבני ה-RNA התקועים הכפולים ב-RNA הכולל, תוכלו לזהות שני מיקרוליטרים של דגימת ה-RNA של 200 ננוגרם למיקרוליטר על קרום הניילון טעון באופן חיובי.
לחצות את הדגימות לממברנה ב 1, 200 microjoules על ידי 100 ב crosslinker UV. חזור על איתור ו crosslinking פעמיים נוספות, אשר יגרום בסך הכל 1.2 מיקרוגרם של RNA לכל כתם. חסום כריכה לא ספציפית עם 5% חלב ב- TBS-T למשך שעה תוך כדי טלטול בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן הסירו את פתרון החסימה, והוסיפו את נוגדן ה-RNA J2 נגד גדילים כפולים בדילול של אחד ל-1, 000 בחלב 1% ב-TBS-T. דגירה הממברנה לילה עם רעידות בארבע מעלות צלזיוס. ביום שלמחר, לשטוף את הממברנה שלוש פעמים עם TBS-T במשך חמש דקות לכל לשטוף.
מוסיפים את הנוגדן המשני, וידגירה את הממברנה במשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן חזור על השטיפה עם TBS-T. מוסיפים את המצע, ומדגירה את הממברנה במשך חמש עד 15 דקות עד לאות הרצוי גלוי.
לעצור את התגובה על ידי שטיפת הממברנה עם מים מזוקקים כפול. כדי לאסוף את דגימות הריאה, מניחים את הריאות על ניירות רקמות, ובונים חתיכה אחת קטנה של כל אונה ריאות. מניחים כל חתיכה לתוך צינור שני מיליליטר המכיל חרוזים.
כדי לאסוף lavage ברונכואלוולרית, לחטא עכבר המתת חיטוי עם 70% אתנול, ולהשתמש מספריים לחתוך את העור מהאזור העליון של הבטן לצוואר. בעדינות למשוך את בלוטות הרוק ואת שריר sternohyoid לגזרים עם מדחפים כדי לחשוף את קנה הנשימה. ואז למקם חוט ניילון מתחתיו.
לעשות חתך בקנה הנשימה כשני מיליליטר מתחת לגרון רק מספיק כדי להכניס קנולה, ולקשר את החוט סביב קנה הנשימה והקנה. צרף מזרק לסוף ה Cannula, ולטעון אותו עם PBS-EDTA טרי. ואז להזריק ולהשראה מיליליטר אחד של הפתרון לתוך הריאה.
נתק את המזרק מהקנולה, ופלט את הפתרון לצינור של 15 מיליליטר. חזור על תהליך זה לקרח עם PBS-EDTA טרי, ובריכה lavage. צנטריפוגה הצינור ב 500 פעמים g במשך שבע דקות בארבע מעלות צלזיוס.
ואז להקליט את עוצמת הקול, ולהעביר את העל טבעי לשני צינורות 1.5 מיליליטר מבלי להפריע גלולה. לאחר שימוש חוזר גלולה, להעביר 150 microliters לתוך צלחת 96 היטב, צנטריפוגה את הצלחת במשך שבע דקות ב 500 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס. ואז במהירות להפוך את הצלחת על נייר טישו כדי להסיר את supernatant.
הכתם את התאים בנוגדנים במאגר FACS בנוכחות נוגדן חוסם 2.4G2, והדרגר את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות בחושך. לאחר הכתמה, צנטריפוגה את הצלחת כדי גלולה את התאים ב 500 פעמים g במשך שבע דקות בארבע מעלות צלזיוס. הסר את פתרון הכתמים על ידי היפוך הצלחת על נייר טישו.
הוסף 100 מיקרוליטרים של מאגר FACS כדי לשטוף את התאים ולאחר מכן חזור על הצנטריפוגה. בצע שימוש חוזר בדגימות ב- 150 מיקרוליטרים של מאגר FACS ולאחר מכן העבר אותם לצינורות FACS המכילים 350 מיקרוליטרים נוספים של מאגר. הוסף 25 מיקרוליטרים של חרוזי ספירה לכל מדגם, והמשך בניתוח ציטומטריית זרימה.
נוכחותם של מבני רנ"א ארוכים דו-תקעים בקרדית אבק הבית, חרקים ובעלי חיים קטנים שאינם חרקים נבדקה על ידי כתם נקודה באמצעות נוגדן חד שבטי כפול, ספציפי לעכבר RNA. RNase III שימש לעיכול RNA כפול תקוע לתוך 12 עד 15 שברי זוג בסיס, אשר היו בלתי ניתנים לגילוי על ידי J2. היכולת של קרדית אבק הבית RNA הכולל לעורר תגובה חיסונית המולדת בריאות העכבר הוכח על ידי RT-qPCR. הטיפול RNase III ביטל את הפעילות immunostimulatory של RNA סה"כ קרדית אבק הבית, המציין כי מבני RNA כפול תקועים חיוניים לפעילות חיסונית המולדת בריאות.
ההשפעה המעכבת של קרדית אבק הבית RNA הכולל על התפתחות של סוג חמור שתי דלקת ריאות הוערכו עם ניתוח FACS. דלקת ריאות אאוזינופילית נגרמה על ידי תמציות קרדית אבק, אשר טופלו עם או בלי RNase III. השפלה של מיני RNA ארוכים דו-גדיליים גרמה לדלקת ריאות מסוג 2 חמורה, שבאה לידי ביטוי במספרים האאוזינופילים המוגברים בשירותים וריאות ברונכואלוולריים.
יש לציין, מספר האאוזינופילים בקבוצה הכוללת RNA קרדית האבק דומה לקבוצה שטופלה בתמצית קרדית האבק המקורית שהכילה באופן אנדוגני את מיני ה- RNA הארוכים התקועים הכפולים. בעת ניסיון פרוטוקול זה, להיות זהיר מאוד בעת הזרקת וזיכרון נוזל BAL, כמו כל נזק לריאות בשלב זה עשוי לשנות את התוצאות הסופיות. בנוסף להליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ELISA כדי לנתח תכנים מסיסים שאינם תאיים הקיימים בנוזל BAL.
לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים לחקור חומרים מיקרוביאליים אחרים הקיימים באלרגנים סביבתיים, כגון גורמי RNA שאינם דו-גדיליים שיכולים לווסת את התפתחות דלקת ריאות אלרגית.
