Этот протокол был разработан для решения очень важного и нерешенного вопроса о том, как присутствующие микробные вещества и экологические аллергены могут регулировать развитие аллергического воспаления. В частности, методы, представленные здесь, могут помочь ответить на вопрос, являются ли двухструнные виды РНК в клещах домашней пыли иммуногенными in vivo и способны модулировать эозинофилическое воспаление легких. Основными преимуществами этих методов являются то, что они просты, эффективны, воспроизводимы и могут быть выполнены с использованием широко используемых инструментов и оборудования.
Эти методы также могут быть использованы для оценки заболеваний легких, вызванных респираторными вирусными инфекциями. Ли Она, аспирантка моей лаборатории, поможет продемонстрировать процедуру. Начните с изоляции общей РНК от аллергенов, насекомых и не насекомых аллергенов.
Перенесите надлежащее количество образца в двухмиллилитровую трубку, содержащую 1,4 миллиметра керамических бусин, и заморозьте трубки в контейнере с жидким азотом примерно на 10 минут. Добавьте один миллилитр гуанидиниума тиоцианата на основе РЕагента изоляции РНК в каждую трубку. Затем разорвать насекомых и не насекомых мелких животных с высокой энергии клеток разрушитель на максимальной скорости в течение 45 секунд.
Охладите образец на льду и повторите этот процесс дважды. Перенесите раствор в новую 1,5-миллилитровую трубку. Добавьте 200 микролитров хлороформа в каждую трубку и вихрем образца.
Центрифуга труб при 14 000 раз г в течение 14 минут при четырех градусах Цельсия. Затем перенесите верхнюю aqueous фазу в новую трубку, содержащую 500 микролитров изопропанола. Смешайте образец.
Затем центрифугировать его при 14 000 раз г в течение 14 минут при четырех градусах Цельсия. Тщательно аспирировать супернатант. Затем промыть гранулы РНК с 500 микролитров 75% этанола, и центрифуга его на 7, 500 раз г в течение 10 минут при четырех градусах цельсия.
Аккуратно удалите всю жидкость. Высушите гранулы и растворите РНК с помощью 20-50 микролитров воды без RNase. Чтобы обнаружить двухструные структуры РНК в общей РНК, обнаружить два микролитера 200-нанограмм на микролитер РНК образца на положительно заряженных нейлоновой мембраны.
Перекрестный переход образцов к мембране на 1200 микроджоулей на 100 в УФ-кросслинкере. Повторите кровянистые пятна и перекрестные ссылки еще два раза, что приведет в общей сложности 1,2 микрограмма РНК на помарку. Блокируйте неспецифическую привязку с 5%молоком в TBS-T в течение одного часа при встряхивании при комнатной температуре.
Затем удалите блокирующий раствор и добавьте антидвухнитное антитело РНК J2 при разбавлении 1 к 1000 в 1%молоке в TBS-T. Инкубировать мембрану на ночь с встряхивания при четырех градусах по Цельсию. На следующий день, мыть мембрану три раза с TBS-T в течение пяти минут за стирку.
Добавьте вторичное антитело и инкубировать мембрану в течение одного часа при комнатной температуре. Затем повторите моет с TBS-T. Добавьте субстрат и инкубировать мембрану в течение пяти-пяти минут, пока не будет виден желаемый сигнал.
Остановите реакцию путем полоскания мембраны двойной дистиллированной водой. Чтобы собрать образцы легких, поместите легкие на бумаги ткани, и акциз один маленький кусочек каждой доли легких. Поместите каждый кусок в двухми миллилитровую трубку, содержащую бисер.
Для сбора бронхоалвеолярной лаваж, дезинфицировать усыпляемую мышь с 70% этанола, и использовать ножницы, чтобы сократить кожу от верхней части живота до шеи. Аккуратно потяните слюнные железы и стернохиоидные мышцы друг от друга с типсами, чтобы разоблачить трахею. Затем поместите нейлоновую веревку под нее.
Сделать разрез в трахее примерно два миллилитров под гортанью достаточно, чтобы вставить канюлю, и узел строки вокруг трахеи и канюли. Прикрепите шприц к концу канюли и загрузите его свежим PBS-EDTA. Затем вводят и аспирируют один миллилитр раствора в легкие.
Отсоедините шприц от канюли и выбросите раствор в 15-миллилитровую трубку. Повторите этот процесс на лед со свежим PBS-EDTA, и бассейн лавы. Центрифуга трубки при 500 раз g в течение семи минут при четырех градусах цельсия.
Затем завехайте громкость и перенесите супернатант на две 1,5-миллилитровые трубки, не нарушая гранулы. После повторного перерасхода гранул, передача 150 микролитров в 96-хорошо пластины, и центрифуга пластины в течение семи минут при 500 раз г и четыре градуса по Цельсию. Затем быстро инвертировать пластину на бумаге, чтобы удалить супернатант.
Пятно клеток с антителами в буфере FACS в присутствии 2.4G2 блокирующих антител, и инкубировать пластины при комнатной температуре в течение 30 минут в темноте. После окрашивания центрифуга пластины гранулировать клетки при 500 раз g в течение семи минут при четырех градусах Цельсия. Удалите раствор окрашивания, инвертирование пластины на бумаге.
Добавьте 100 микролитров буфера FACS для мытья клеток, а затем повторите центрифугу. Повторное использование образцов в 150 микролитров буфера FACS, а затем передать их в FACS труб, содержащих дополнительные 350 микролитров буфера. Добавьте 25 микролитров подсчета бусин в каждый образец и приступайте к анализу цитометрии потока.
Наличие длинных двухструнные структуры РНК в доме пылевых клещей, насекомых и не насекомых мелких животных был рассмотрен точка пятно с использованием двойной мель, РНК-специфических моноклональных антител мыши. RNase III был использован для переваривания двухместной РНК в 12 до 15 фрагментов базовой пары, которые были необнаружимы J2. Способность домашней пыли клеща общей РНК, чтобы стимулировать врожденный иммунный ответ в легких мыши было продемонстрировано RT-qPCR. Лечение RNase III отменил иммуностимуляторной активности домашней пыли клеща общей РНК, что свидетельствует о том, что двухструйные структуры РНК имеют важное значение для врожденной иммунной активности в легких.
Ингибирующее воздействие рнк клеща домашней пыли на развитие тяжелого воспаления легких типа 2 оценивалось с помощью анализа FACS. Эозинофилическое воспаление легких было вызвано экстрактами пылевых клещей, которые лечились с помощью или без RNase III. Деградация длинных двухструхих видов РНК привела к серьезному воспалению легких второй типа, что нашло отражение в увеличении числа эозинофилов в бронхоалвеолярных лавах и легких.
Примечательно, что количество эозинофилов в общей группе РНК-обработанных пылевых клещей сопоставимо с группой, обработанной оригинальным экстрактом пылевых клещей, который эндогенно содержал длинные двухструвые виды РНК. При попытке этого протокола, будьте очень осторожны при введении и вспоминая жидкости BAL, так как любое повреждение легких на данном этапе может изменить окончательные результаты. В дополнение к этой процедуре, другие методы, такие как ELISA могут быть выполнены для анализа неклеточного растворимого содержимого, присутствуют в жидкости BAL.
После своего развития, этот метод проложил путь для исследователей, чтобы исследовать другие микробные вещества, присутствующие в экологических аллергенов, таких как не-двойной мель РНК-факторов, которые могут регулировать развитие аллергического воспаления легких.
